Методы определения клостридий, протея в мясных продуктах

Клостридии – споровые палочки, культивируются на 2-ух средах: СЦС(сульфит-циклосерная среда), Вильсона-Блера.

Протекает р-ция с образованием FeS – черная колония.

Разлив пробы в 7 пробирок, из каждого разведения вносится в среду Вильсона-Блера, Т=37⁰С,3 суток. Цвет поменяется-м/о.

На среде Кита-Тароти нужно смотреть за наличием запаха, изменением цвета. Если есть изменение цвета и запаха, то проводится микроскопирование.

Клостридии отличаются способностью расти без доступа О₂, формируют эндоспоры, разлагают полисахариды и белки, не требовательны к составу среды. Это те факторы, которые отличают клостридии от др. м/о, и их следует положить в основу элективного метода культивирования. Необходимо приготовить полусинтетическую питательную среду, в которой источником углерода и энергии явл.,напр., крахмал или какой-либо белок. Пробы можно отбирать из богатых органикой почв. После внесения пробы в среду полученную суспензию следует подвергнуть пастеризации, чтобы оставить жизнеспособными одни эндоспоры. Культивирование нужно осуществлять ванаэробных условиях, чтобы исключить доступ О₂.

Протеи бывают 2 форм: н-форма (подвижная), о-форма (неподвижная).

Определяют есть подв. форма или нет: скошенный питательный агар, отбирают колонию м/о со среды Энда, и вносят на пит. агар на дно пробирки, ставят на 37⁰, если подв. форма, то она сама начнет ползти. Если нет ползучего налета – м.б. о-форма, а может и не быть протей.

Затем используют среду Плоскарева: засев на сутки, Т=37⁰С. Смотрят образуются колонии. На этой среде растут только патогенные м/о, чаще протеи. Протея образует желтыи колонии, их отбирают и пересеивают на среду Крумвиде-Алькеницкого (здесь добавлена мочевина).Протеи могут активировать мочевину, они выделяют Н₂S, не используют лактозу. Колонии меняют цвет на черный =>

25. Характеристика методов посева и культивирования м/о. Периодическое и непрерывное культивирование м/о.

Питательные среды:

- жидкие

- твердые: агаризованные

белковые среды(коллаген, казеин)

1. Посев петлей

В пробирку вносят петлей м/о и ставят в термостат

3. М-д наиболее вероятного числа

Используют таблицы

10^-2 10^-1 10⁰ 10¹ 10² 10³

вероятностные

методы

Чтобы определить вероятность: из нескольких пробирок (100) ч/з определенное время наблюдают помутнение, значит там есть хотя бы одна клетка м/о, которая начала размножаться.

М-ды посева на тв. средах:

1 ) М-д посева уколом: пробирка заливается расплавленным агаром, снимают петлей м/о, прокаливается среда

-м/о могут развиваться на поверхности (аэробы)

-на глубине (анаэробы)

-факультативные аэробы

Если газообразующие, то в агаре будут трещины

3) М-д посева в агар (м-д Коха)

плавят агар (90Сº), охлаждают на водяной бане до 50 Сº, добавляют 1 мл суспензии м/о на чашку и вливают агар (10-12мл), перемешивают пока не застынет агар, ставят в темостат.

4) М-д Дригальского (посев на агар)

В чашку заливают распл.агар и накрывают фильтровальной бумагой, застывает, переварачивают и так хранят. Готовят суспензию м/о путем разведения и из последней отбирается 0,1 мл и наносят ее на чашку, и стерилизованным шпателем разобщают м/о по всей поверхности агара. Разведение надо, чтобы не образовывались ассоциаты.

Число колоний: бактерии-10-300

дрожжи-10-150

плесень- 1-50

Подсчитывают число в противоположных секторах, находят среднее и умножают на 4 и получают число колоний

5) М-д исчерпывающего штриха

Чашка заливается агаром, берут петлю м/о и делают несколько штрихов в одном направлении, петлю стерилизуют и делают штрих

эти отдельные колонии анализируют, предварительно определяют чистоту м/о

Стадии метода посева и культивирования

Стадии	Жидкие	Твердые
1. Подготовка проб -анализ с поверхности -анализ из глубины 2.Приготовление разведений 3.Посев 4.Культивирование 5.Подсчет м/о	- - +   + + +/-	+ + +   + + +

Культивирование микроорганизмов сопровождается увеличением их количества и массы и может преследовать разные цели: накопление клеток, обогащение смешанной популяции представителями определенной группы, получение чистой культуры, получение целевого продукта, перевод клеток в нужную фазу роста и др. В результате выращивания микроорганизмов получают их культуру. В зависимости от методов культивирования можно получить чистую и смешанную культуры, культуру клеток в разных фазах роста, синхронизированную и асинхронную, активно метаболизирующую и находящуюся в состоянии анабиоза. С помощью элективных методов культивирования можно выделить из окружающей среды микроорганизмы определенной группы с желаемыми свойствами.

В большинстве случаев культивирование микроорганизмов требует поддержания определенной температуры, поскольку они, как известно, не имеют систем терморегуляции и в высокой степени чувствительны к изменению данного фактора. Культивирование при постоянной температуре называют инкубированием и осуществляют в термостатах. Кроме температуры, при культивировании следует учитывать влияние и других физических и химических факторов на рост микроорганизмов.

При культивировании клеток в жидких средах получают жидкие культуры - суспензии микроорганизмов. О том, что в жидкой среде имеет место рост клеток, можно узнать по культуральным признакам: помутнению среды, появлению пузырьков газа, изменению цвета, формированию на поверхности среды пленки, а на стенках сосуда - пристеночного кольца и т. п. Среди перечисленных признаков наиболее характерным является развитие мутности. Обычно мутность бактериальной суспензии становится визуально различимой, когда концентрация клеток в ней достигает 10⁶ в 1 мл, а дрожжевой - 10⁵ в 1 мл. В жидких культурах таких крупных микроорганизмов, как водоросли и простейшие, концентрация клеток обычно не превышает 10³ в 1 мл, и суспензии остаются прозрачными. Однако и в этом случае можно зарегистрировать признаки роста: бесцветные клетки простейших формируют не однородность в суспензии, напоминающую битое стекло, а водоросли обеспечивают изменение цвета суспензии за счет фотосинтезирующих пигментов.

Получение суточной культуры. Инкубирование суточной культуры длится обычно 16-18 ч, захватывая ночное время суток. Эта культура представляет собой суспензию клеток в жидкой питательной среде, в ней достигается максимальная концентрация микроорганизмов и популяция обычно находится в стационарной фазе роста.

Суточная культура очень часто используется при работе с микроорганизмами в качестве стартовой: из нее получают клетки в логарифмической фазе роста, ею инокулируют питательные среды для увеличения объема культуральной жидкости с целью извлечения клеточной массы, эту жидкую культуру удобно ис­пользовать для изучения свойств клеток и т. п.

Обычно для аэробных и факультативно анаэробных микро­организмов суточную культуру получают инокулируя изолированной колонией 2 мл подходящей по составу полноценной жидкой питательной среды. Обязательным условием получе­ния суточной культуры является подготовка контроля за соблюдением правил асептики. Поступают следующим образом. В две стерильные пробирки вносят одной и той жестерильной пипеткой по 2 мл полноценной питательной среды. Пробирки маркируют. Затем в одну из них (опытную) петлей засевают изолированную колонию микроорганизма. Помещают посевы в термостат и инкубируют 16-18 ч. Перед использованием суточной культуры следует убе­диться, что среда в контрольной пробирке осталась прозрачной и не имеет иных признаков роста микроорганизмов. В против­ном случае приходится констатировать, что условия асептики не были соблюдены ив опытной суспензии содержатся пос­торонние микроорганизмы, то есть использовать такую культу­ру нельзя!

Получение культур в логарифмической фазе роста. Часто для проведения экспериментов с микроорганизмами требуется получить клетки в фазе физиологической молодости, которые де­монстрируют наибольшую физиологическую активность, отлича­ются стандартизированными параметрами, наиболее чувстви­тельны к факторам окружающей среды. Известно, что такие клет­ки составляют популяцию, пребывающую в логарифмической фа­зе роста. Чтобы обеспечить переход популяции в данную фазу, не­обходимо создать наиболее благоприятные условия культивирова­ния для микроорганизмов. Например, по отношению к бактериям Е. соli следует поступить следующим образом. Необходимо су­точную культуру этих бактерий (в ней клетки находятся в стацио­нарной фазе роста) развести питательным бульоном, чтобы обеспечить клетки питательными веществами, уменьшить их числен­ность и концентрацию продуктов метаболизма. Обычно разводят суточные культуры в 10-100 раз. Поскольку известно, что данные бактерии более энергично растут в условиях аэрации, следует поместить суспензию в плоскодонную колбу, заняв небольшую часть ее объема и культивировать в термостатированной роторной качалке при 37Сº. Для достижения популяцией бактерий кишечной палочки средней логарифмической стадии роста бывает достаточно 3-4ч.

Методы периодического и непрерывного культивирования

Культивирование микроорганизмов в жидкой среде можно осуществлять в закры­той системе (пробирка, колба, ферментер), где постоянно изменяются условия и культура проходит несколько фаз роста, а также в открытой системе, которая позволяет производить обмен среды. Первый способ культивирования называется периодическим. Он позволяет поддерживать раз­множение клеток только в течение ограни­ченного времени — на протяжении экспо­ненциальной фазы роста.

Открытая система обеспечивает непре­рывное (проточное) культивирование, при котором рост клеток происходит постоянно, в течение всего времени культивирования. Если скорость подачи свежей среды уравно­вешивает скорость отбора культуральной жидкости (а вместе с ней продуктов метабо­лизма и части клеток) и суспензия хорошо перемешивается, то рост популяции поддер­живается на одной и той же стадии логариф­мической фазы роста. Такая система назы­вается равновесной. В ней достигается со­стояние динамического равновесия между двумя экспоненциальными процессами: удельной скоростью роста культуры и. и ско­ростью вымывания клеток из сосуда D, ко­торая определяется отношением скорости подачи среды в сосуд F к объему жидкости в нем V:

Существуют два основных, принципи­ально различающихся, способа непрерывно­го культивирования, подчиняющихся авто­матическому регулированию: с использова­нием хемостата и турбидостата.

Хемостат. В этом устройстве состоя­ние равновесия достигается путем регулиро­вания скорости роста концентраций посту­пающих субстратов. В основу работы хемостата положена следующая закономерность: скорость роста логарифмической культуры в любой момент времени определяется концентрацией одно­го какого-либо субстрата. Зависимость ско­рости роста от концентрации субстрата опи­сывается кривой насыщения и выражается уравнением Моно (рис. 87).

Рис. 87. Зависимость скорости роста культуры (μ) от концентрации субстрата (S), где К_s— константа насыщения для субстрата (концентрация лимитирующего вещества при скорости роста, достигающей половины максимального значения (μ _мах/2)

Стабильность динамического равнове­сия культуры в хемостате обусловлена тем, что ее рост лимитирует концентрация како­го-либо субстрата (источника углерода, азота, серы или фосфора, донора или ак­цептора электронов). Скорость роста под­держивается на низком уровне. В этом слу­чае реактор приобретает свойства саморе­гулирующейся системы: как только скорость разбавления и вымывания клеток ста­новится выше скорости их роста, увеличи­вается концентрация лимитирующего фак­тора, что влечет за собой увеличение скоро­сти роста. И наоборот: если μ превы­шает D, концентрация лимитирующего фактора уменьшается, а вместе с ней уменьшается и скорость роста.

Хемостат состоит из сосуда-культивато­ра, снабженного перемешивающим устрой­ством и системой подачи кислорода, а так­же двумя выводными отверстиями. Через одно из них подается свежая питательная среда, а через другое отводится культуральная жидкость.

Турбидостат. Представляет собой по­хожее на хемостат устройство, в котором, од­нако, состояние равновесия достигается пу­тем удаления биомассы и замещения ее све­жей средой со скоростью, приближающейся к максимальной скорости роста культуры. В сосуде-культиваторе все питательные веще­ства содержатся в избытке, а плотность кле­ток поддерживается на постоянном уровне с помощью фотоэлектрических датчиков. Сиг­нал от датчика управляет скоростью протока жидкости.