Методы количественного анализа микрофлоры пищевых продуктов

М-ды м/б контроля явл. основой м/б анализа. Осн. назначение: обеспечение м/б безопасности пищевых продуктов. Существует 2 осн. задачи м/б анализа:

- качественный м/б анализ;

- количественный м/б анализ.

Полуколичественные м-ды анализа обеспечивают точность 40 - 20 %,а количественные - < 20%.

Кол-венный анализ делится на анализ общего кол-ва м/о и анализ видового состава м/о. Эти м-ды подразделяются на прямые и косвенные.

Прямые дают абсолютное значение численности м/о: м-ды микроскопии, посева в агар. Косвенные дают параметры (электропроводность), кот. требуют проведения калибровки (не видим м/о, видим результат их действия).

М/б м-ды кол-венного анализа:

1) определение общего кол-ва м/о:

- прямого счета (м-д посчета в камере Горяева, м-д Брида, м-д Королева, м-д подсчета на мембранных фильтрах);

2) определение биомассы:

- весовой;

- химический

3) определение видового состава:

- м-ды культивирования (м-д посева на агаризов. среды, м-д посева на жидк. среды, м-д культивирования на мембр. фильтрах).

М-д определения биомассы:

- взвесить сух. фильтр и бюксы;

- на колбу ложат фильтр;

- фильтруют жидкость с м/о;

- помещают фильтр в стерил. бюкс и высушивают при темп-ре 105 ⁰С до прекращения изменения массы;

- высчитывают число м/о:

N = ΔM / (Δm*V)

V – объем, кот. фильтровали;

Δm – средняя масса м/о вида;

ΔM – разность масс бюксов до и после сушки.

М-д поределения микробн. числа воздуха и воды:

- м-д Коха – Омельянского (чашку Петри заливают питательным агаром и оставляют после застывания на 5-10 мин., м/о с воздуха оседают, чашку закрывают, выдерживают при темп-ре 37⁰С 2 суток и вычисляют число м/о:

N = (а*100*1000*5)/(в*10*t)

а—усредненное кол-во по всем чашкам;

100 – площадь чашки; 1000 – коэф-т пересчета (литры в кл/м³);

в – площадь, где считают число колоний.

- м-д Кротова (более точный). Пропускают через мембр. фильтр опред. объем воздуха. Фильтр с пропущенным воздухом помещают на агар и культивируют при 30⁰С 2 суток:

N = (а*1000)/ V

Прямые методы:

- м-д Королева. Использ. для анализа дрожжей.

Берутся 2 пробирки с известным и неизвестным кол-вом дрожжей, они смешиваются и могут быть предварительно одни из них окрашены, делают мазок, подсчитывают окрашенные и неокрашенные м/о:

N_х = N₀ * (n/m)

n – число окрашенных м/о; m – число неокр. м/о; N₀ – нач. число окраш. м/о; N_х – нач. число неокр. м/о.

Прямые м-ды:

- микроскопии;

- культивирования и посева (обладает высокой чувствительностью (опред. одну клетку), недостаток – длительность (бактерии – 3 суток при 30⁰С, дрожжи и плесени – 5-7 суток 20⁰С);

- смешенные (м-д агаровых капель и пленок, м-д мембр. фильтров (использ. для анализа воздуха и воды).

М-ды посева:

а) посев петлей (в пробирку вносят петлю м/о и ставят в термостат);

б) м-д разведений (бывает с шагом 10 или 100);

в) м-д наиболее вероятного числа (использ. таблицы). Чтобы определить вероятность из нескольких пробирок через опред. время наблюдают помутнение, значит там есть хотя бы одна клетка м/о, кот. начала размножаться.

М-ды посева на твердых средах:

1) м-д посева уколом: пробирка заливается расплавл. агаром, снимают петлей м/о. прокал-ся среда

- м/о могут развиваться на поверхности (аэробные);

- на глубине (анаэробные).

Если газообразующие, то в агаре будут трещины.

2) м-д посева на скошенный агар. В пробирку на 1/3 часть заливается агар и пробирку помещают в штатив, агар растекается. Затем добавляют физ. р-р и перемешивают, отбирают необходимый объем и переносят в др. пробирку, с кот. и ведут анализ.

3) м-д посева в агар (м-д Коха). Плавят агар (90⁰С), охлаждают на водяной бане до 50⁰С; добавляют 1 мл суспензии м/о на чашку и вливают агар (10-12 мл), перемешивают пока не застынет агар, ставят в термостат.

4) м-д Дригальского (посев на агар). В чашку заливают растопл. агар и закрывают фильтровальной бумагой, застывает (10-15 мин.), переворачивают и так хранят. Готовят суспензию м/о путем разведения и из последней пробирки отбирается 0,1 мл, наносят ее на чашку и стерильным шпателем разобщают м/о по всей поверхности агара. (Разведение необх., чтобы не образовывались ассоциаты).

Стадии метода посева и культивирования

Стадии	Жидкие	Твердые
1. Подготовка пробы:
- анализ поверхности	-	+
- анализ из глубины	+	+
2. Приготовление разведений	+	+
3. Посев	+	+
4. Культивирование	+	+
5. Подсчет м/о	+/-	+

17. Общая схема определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных м/о методом культивирования.

Для определения мезофильных аэробных м/о проводят посев м/о на поверхность агаризирован. питательной среды в чашках Петри.

Посев можно проводить петлей или стеклянным шпателем. При посеве отбирают клетки м/о с агаризированной или жидкой питат. среды, приоткрывают крышку чашки Петри и на поверхности среды проводят штрихи. Чашку закрывают и ставят крышкой вниз. Штрихи могут быть обычными или исчерпывающими. Исчерпывающий метод: механическое разделение клеток м/о на поверхности агаризированной питат. среды. Петлей отбирают небольшое кол-во культуры и проводят высев параллельными штрихами на поверхность агазир. питат. среды в чашках Петри. Петлю обжигают, если она остынет, проводят ею несколько штрихов перпендикулярно первым. Петлю стерилизуют и наносят штрихи в направлении, перпендикулярном предыдущему посеву.

При посеве м/о с жидкой питат. среды на поверхность агаризированной среды в чашке Петри шпателем действуют таким образом. Приоткрывают крышку чашки Петри и на поверхность среды наносят пипеткой на 0,1 мл разведенную культуру, которую круговыми движениями шпателя размещают по всей поверхности. Для этого м-да часто надо делать серийные разведения суспензий м/о так, чтобы на поверхности среды в чашке Петри выявилось 100-300 колоний, каждая из кот. получается в результате размножения одной исходной клетки.

Разведение готовят в физ. р-ре (ФР), шаг разведения 10 или 100. Для приготовления разведений с шагом 10 стерильный ФР разливают по 4,5 мл в пробирки. Затем в первую пробирку вносят 0,5 суспензии м/о – это первое разведение. Содержимое пробирки перемешивают, новой пипеткой отбирают 0,5 мл этой суспензии и переносят в др. пробирку с 4,5 мл ФР и т.д. Для приготовления разведений с шагом 100 делают те же действия, только смешивают ФР с клетками в пропорциях 9,9 мл ФР + 0,1 мл суспензии клеток. Степень разведения зависит от плотности доследуемой популяции м/о.

Для определения факультативно анаэробных м/о проводят глубинный посев м/о в агаризирован. питательную среду.

Для этого агаризированную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. Перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную горелку, чтобы среду расплавить. Затем пробирки переносят в ультротермостат при 45⁰С на 10 мин для охлаждения питательной среды. В каждую пробирку вносят пипеткой 0,1 мл разведенной жидкой культуры м/о. Содержимое пробирки перемешивают, выливают в чашку Петри. После застывания среды чашку помещают в термостат.