Микробиологические питательные среды, их классификация и м-ды контроля

Выделение микроорганизмов из внешней среды, идентификация, наращивание биомас­сы, поддержание культур, изучение их свойств, селекция продуктивных вариантов — все эти лабораторные приемы требуют ис­пользования разнообразных питательных сред для микроорганизмов.

Прежде чем приступить к характеристи­ке разнообразных питательных сред, следует рассмотреть универсальные требования, предъявляемые к ним:

-питательная среда должна содержать достаточные количества биогенных, макро- и микроэлементов в составе тех веществ, ко­торые используются данными микроорганизмами. При этом следует учитывать тип питания микроорганизмов;

-для инкубирования ауксотрофных мик­роорганизмов среда должна содержать необ­ходимые факторы роста;

-среда должна содержать достаточное количество воды, чтобы все вещества в ее составе были в растворенном состоянии. Следует также учитывать потребность куль­тивируемого микроорганизма к степени влажности, активности воды;

-среда должна характеризоваться опре­деленным для данного микроорганизма значением рН и, по возможности, обладать вы­сокой буферной емкостью, поскольку в про­цессе роста культуры микроорганизмов вы­деляют продукты обмена (чаще кислые), способные сильно изменить рН;

-среда должна быть стерильной.

Классифицируют среды по составу, консистенции и назначению.

Характеристика сред по составу. Различают натуральные, синтетические, полусинтетические и живые питатель­ные среды.

Натуральные пита­тельные среды готовят из продуктов живот­ного или растительного происхождения: со­ков, молока, крови, отваров, вытяжек, экс трактов мяса или органов животных, плодов или других частей растений. Эти среды име­ют неопределенный состав и содержат все необходимые микроорганизмам компонен­ты. Примерами натуральных сред являются: мясопептонный бульон (МПБ) — экстракт мяса и костей, пригоден для культивирова­ния многих бактерий; солодовое сусло — получают при выдерживании в воде измель­ченных пророщенных зерен ячменя в процессе чего нерастворимая часть солода (крахмал и частично белки) под действием ферментов переходит в раствор (осахаривание), эта среда пригодна для выращивания грибов, в том числе дрожжей; картофельный отвар — применяют для фитопатогенных микроорганизмов; питательный бульон (ПБ) — гидролизат кильки или мясокостных субстратов, используют для культивирова­ния широкого круга бактерий. Натуральные среды чаще всего используют для наращива­ния биомассы, поскольку культуры на этих средах обычно быстрее растут. Кроме этого, полноценные среды используют для хранения микроорганизмов и культивирования тех из них, чьи питательные потребности не выявлены.

Синтетические среды имеют оп­ределенный состав. Они готовятся из чистых веществ — источников нужных микроорга­низмам химических элементов и содержат эти вещества в строго определенных количе­ствах. Такие среды пригодны для культивиро­вания микроорганизмов, чьи питательные по­требности четко определены. На этих средах можно получать стабильные результаты.

Полусинтетические среды готовят на основе синтетических, но в качестве источников факторов роста добавляют неболь­шие количества каких-либо натуральных продуктов.

Живые среды используют для культиви­рования микроорганизмов, способных раз­множаться только в живых клетках. Напри­мер, для культивирования бактериофагов жи­вой питательной средой будет служить куль­тура чувствительных бактерий; для вирусов растений — культура тканей соответствую­щих растений или сами растения; для виру­сов животных — культура тканей животных или развивающиеся куриные эмбрионы.

Характеристика сред по консистен­ции. Различают жидкие, плотные, полужид­кие и сыпучие питательные среды.

Жидкие среды не содержат уплотните­лей и чаще всего используются для накопле­ния биомассы микроорганизмов.

Плотные (твердые) среды отличаются от жидких наличием уплотнителя, и после его желирования приобретают относитель­ную твердость. На плотных средах появляет­ся возможность разобщить клетки микроор­ганизмов и получить изолированные коло­нии, дающие начало чистой культуре. Следует заметить, что не все микроорганизмы способны расти на плотных средах: на них формируют колонии прокариоты, слизевики и грибы. Водоросли и простейшие культивируются только в жид­ких средах. В качестве уплотнителей для твердых сред чаще всего используют агар-агар, желатин и силикагель.

Агар-агар представляет собой сложный полисахарид, который извлекают из талломов красных водорослей. Существенными преимуществами агара перед другими уп­лотнителями являются следующие:

1) высо кая температура плавления, составляющая для 2%-ного геля 98°С. Температура за­твердевания 2%-ного раствора агара состав­ляет 42°С;

2) этот сложный органический полимер не утилизируется в качестве источ­ника углерода и энергии большинством мик­роорганизмов, а значит, не разжижается при их культивировании;

3) агар используется в малых концентрациях — для получения плотной среды достаточно внести в нее 1,5% агар-агара

Желатин — это белковый материал, кото­рый получают из богатых коллагеном субст­ратов (костей, хрящей, сухожилий). Он име­ет очень низкую температуру плавления (25-27°С), что является существенным недо­статком. Еще один недо­статок желатина состоит в том, что он гидролизуется многими микроорганизмами, разжижаясь при этом. Для уплотне­ния сред используются довольно высокие концентрации желатина: 15-20%.

Силикагель отлича­ется от других уплотнителей тем, что это — неорганическое вещество. Недо­статком силикагеля являются большая слож­ность и длительность процедур приготовле­ния пластин из него.

Полужидкие среды готовятся на основе жидких с добавлением меньшего количества уплотнителей, поэтому имеют "мягкую" консистенцию. Эти среды используют для работы с бактериофагами, для хранения культур, в тестах на разжижение желатина, в методах определения диффузии веществ в среду и др.

Сыпучие среды ис­пользуют иногда для хранения культур, для твердофазной ферментации в производ­стве, например при культивировании грибов на отрубях, лигнине, верховом торфе и др.

Характеристика сред по назначению. Обычно выделяют накопительные, электив­ные, дифференциально-диагностические и селективные среды.

Накопительные среды используют для накопления биомассы определенных видов микроорганизмов. Чаще это жидкие среды, иногда — плотные. В большинстве слу­чаев — натуральные.

Элективные среды служат для выделе­ния микроорганизмов с определенными свойствами из природных источников. Их особенностью является такой состав, кото­рый способствует преимущественному раз­витию какой-либо одной группы микроорга­низмов и ограни­чивает развитие остальных. Чаще всего это жидкие синтетические или полусинтетичес­кие среды. Например, для выделения из внешней среды прототрофных бактерий, способных сбраживать лактозу, следует при­готовить синтетическую среду с лактозой в качестве единственного источника углерода и энергии — она и будет элективной для дан­ных бактерий.

Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды позволяют различать микроорганизмы разных групп по внешнему виду: обычно по изменению окраски колоний или самой среды. Чаще всего такие среды со­держат один или несколько индикаторов, ко­торые реагируют на изменение рН или подвергаются окислению-восстановлению. Кон­систенция этих сред в большинстве случаев плотная или полужидкая. Среды данной кате­гории используют при идентификации мик­роорганизмов. Например, широко распрост­раненная агаризованная среда ЕМВ используется для выявления энтеробактерий среди других бактерий в про­бах пищи, воде, клинических изолятах и др. Редкая способность энтеробактерий сбражи­вать лактозу регистрируется на среде ЕМВ по изменению цвета колоний и среды вокруг них (синий с металлическим блеском) за счет кислых продуктов, брожения, сдвигающих рН. Не сбраживающие лактозу бактерии фор­мируют неокрашенные (розовые) колонии.

Селективные среды служат для отбора потомства микроорганизмов после событий генетического обмена. Эти среды составля­ются таким образом, чтобы обеспечить рост только определенных микроорганизмов и предотвра­тить рост родительских форм. Это, как пра­вило, синтетические среды, содержащие ан­тибиотики и лишенные определенных фак­торов роста.

28.Принципы культивирования м/о, виды питательных сред и принципы их составления.

Принципы составления питательных сред:

- питательная среда должна содержать достаточные количества биогенных, макро- и микроэлементов в составе тех веществ, которые используются данными микроорганизмами;

- среда должна содержать факторы роста;

- среда должна содержать достаточное количество воды, чтобы все вещества в ее составе были в растворенном состоянии;

- среда должна хорошо характеризоваться определенным для данного микроорганизма значением pH, обладать высокой буферной емкостью,т.к. в процессе роста культуры микроорганизмов выделяют продукты обмена, способные сильно выделять рН;

- среда должна быть стерильной.

Среды

1)по составу:

а)натуральные: питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения: соков, молока, крови.(мясопептонный бульон, солодовое сусло, картофельный отвар, питательный бульон). Используют для наращивания биомассы, для хранения микроорганизмов и культивирования тех из них, чьи питательные потребности не выявлены.

б) синтетические: имеют определенный состав, готовятся из чистых веществ. Пригодны для культивирования микроорганизмов, чьи питательные потребности четко определены. Используют в генетических экспериментах, являются основой селективных сред.

в) полусинтетические: готовят на основе синтетических, но в качестве источников факторов роста добавляют натуральные продукты.

г) живые: используют для культивирования микроорганизмов, способных размножаться только в живых клетках.

2) по консистенции:

а) жидкие не содержат уплотнителей и чаще всего используются для накопления биомассы микроорганизмов;

б) плотные отличаются от жидких наличием уплотнителя и после его желирования приобретают относительную плотность. На плотных средах есть возможность разобщить клетки микроорганизмов и получить изолированные колонии, дающие начало чистой культуры: агар-агар, желатин, силикогель;

в) полужидкие: готовятся на основе жидких с добавлением меньшего количества уплотнителя, поэтому имеют мягкую консистенцию.

г) сыпучие: используют для хранения культур для твёрдофазной ферментации в производстве.

3)по назначению:

а) накопительные используют для накопления биомассы определённых видов микроорганизмов. Чаще – жидкие, иногда – плотные среды, в большинстве случаев – натуральные.

б) элективные: для выделения микроорганизмов с определёнными свойствами из природных источников. Их состав способствует преимущественному развитию какой-либо одной группы м/о. Чаще – жидкие синтетические или полусинтетические среды.

в) дифференциально-диагностические среды позволяют различать м/о разных групп по внешнему виду(по изменению окраски колоний или самой среды).Консистенцию сред плотную или полужидкую. Используют для идентификации м/о.

г) селективные служат для сбора потомства м/о после событий генетического обмена, обеспечивают рост только определённых м/о и предотвращают рост родительских форм. Это синтетические среды, содержащие антибиотики и лишенные определённых факторов рост.

29.Чистые культуры клеток, их получение и изучение свойств м/о.

Чистой культурой считают потомство одной клетки (споры, вирусной частицы). Легче всего получить чистую культуру на плотной среде, где клетки могут быть разоб­щены, так что каждая из них сформирует от­дельную (изолированную) колонию, или клон. Для тех микроорганизмов, которые не культивируются на плотных средах (водо­росли, простейшие), чистые культуры полу­чают методом предельных разведений в жидкой среде, стараясь так развести исход­ную суспензию, чтобы в пробирку попала только одна клетка, которая при размноже­нии даст чистую культуру.

В большинстве случаев чистые культуры микроорганизмов получают из элективных культур (смешанная культура м/о, включающая более чем один вид, но количественно преобладают в ней м/о с определенными свойствами - те которые хотят выделить из окружающей среды). Чтобы обеспечить формирование колоний нужных микроорга­низмов на плотной среде, первый высев де­лают также на элективную среду. Получив изолированные колонии, отбирают наиболее типичные из них (или руководствуются изве­стными морфологическими характеристика­ми колоний) и подвергают троекратной "рас­чистке". Эта процедура необходима для того, чтобы избавиться от посторонних микроор­ганизмов, которые часто присутствуют в ко­лониях, полученных при высеве из электив­ных сред.

"Расчистка" представляет собой после­довательные пересевы изолированных коло­ний на плотные среды одним из выбранных методов. При этом хотя бы единожды в ходе трех пересевов следует поместить микроор­ганизмы на полноценную среду, обеспечива­ющую рост большинства микроорганизмов данной группы. На такой среде сопутствую­щие основному организму "примеси" сфор­мируют колонии и станут заметными.

Полученные на последнем этапе "расчи­стки" изолированные колонии следует под­вергнуть микроскопическому контролю, и лишь убедившись, что клетки в их составе однородны, можно считать каждый клон чи­стой культурой.