Роль Wnt-сигнального пути в сохранении плюрипотентности и в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мышей

Wnt-сигнальный путь функционирует на важнейших этапах эмбрионального развития—гаструляции, определения передне-задней оси зародыша, закладке центральной нервной системы и в других процессах. Wnt-путь необходим для дифференцировки и пролиферации клетокпредшественников разных тканей типов, в частности для сохранения делящихся клеток эпителия кишечника и стволовых клеток крови. Дерегуляция Wnt-пути является важным этапом в процессе канцерогенеза разных типов опухолей. мЭСК обладают чертами трансформированных клеток (высокой скоростью пролиферации, не зависимым от ростовых факторов делением), а с другой стороны, их можно рассматривать как популяцию клеток- предшественников, поскольку внутреннаяя клеточная масса (источник мЭСК) существует в организме короткое время. Данные об активности Wnt-пути в ходе ранних этапов эмбриогенеза мыши достаточно противоречивы.

В ряде исследований с применением ПЦР в реальном времени, микрочипов и гибридизации in situ показано, что на стадии бластоцисты мыши экспрессируются лиганды Wnt3a, 4, 6, 6b, 10b и секретируемые антагонисты Sfrp1 и Dkk1 (Lloyd et al., 2003; Kemp et al., 2005). При инъекции мРНК, кодирующей в-катенин, сшитый с GFP, на стадии дробления в-катенин—GFP локализуется в ядрах клеток эпибласта. Недавно было показано, что культивирование ЭСК с ингибитором киназы GSK3в (BIO), предположительно активирующее Wnt-путь, способствует поддержанию плюрипотентного состояния ЭСК мыши и человека. Добавление BIO активирует TCF-зависимую репортерную конструкцию Top-Flash и сохраняет недифференцированное состояние мЭСК в отсутствие фактора LIF (Sato et al., 2004).

Однако данные других работ свидетельствуют о том, что канонический Wnt-путь, включающий в себя подавление деградации в-катенина и транслокацию в-катенина

в ядро, не играет роли в преимплантационном развитии и активируется позднее в ходе гаструляции. У мышей, нокаутированных по гену, кодирующему лиганд Wnt3a, не обнаружено существенных нарушений на стадии бластоцисты, но развитие на стадии первичной бороздки прекращается (Liu et al., 1999). Эмбрионы мышей, нокаутированных по бета-катенину, не имеют нарушений вплоть до начала гаструляции. В местах адгезионных контактов внутренней клеточной массы вместо бета-катенина детектируется плакоглобин, а сама внутренняя клеточная масса выглядит так же, как и у мышей дикого

типа. У нокаутированных эмбрионов отмечается нарушение формирования первичной мезодермы и переднезадней оси эмбриона (Haegel et al., 1995; Huelsken et al., 2000).

Интересный подход для исследования роли бета-катенина в ходе раннего эмбрионального развития был применен с использованием регулируемой экспрессии рекомбиназы CRE под контролем промотора Zp3 (zona pellucida — гена, экспрессируемого в ооцитах). Для того чтобы исследовать возможный вклад ядерного в-катенина на ранних стадиях развития эмбриона мыши до имплантациискрестили самцов мышей, экспрессирующих Zp3-cre (рекомбиназу Cre под промотором гена zona pellucida), с самками, гомо- или гетерозиготными по гену в CatEx3flox, в котором последовательность экзона 3 фланкирована сайтами loxP. Белок, получающийся в результате вырезания фланкированной последовательности, является стабилизированным и, следовательно, конститутивно активным. Эмбрионы дикого типа и мутантные не отличались друг от друга и развивались до стадии бластоцисты. Особенно интересно то, что в бластоцистах вCatДEx3 в-катенин располагался в области клеточной мембраны, но не в ядре или цитоплазме. Заметные различия отмечались на постимплантационных этапах. На стадии E6.5 эмбриональная доля мутантного зародыша была уменьшена в размере и выглядела как дезорганизованная масса клеток, в некоторых из них отмечалась локализация в-катенина в цитоплазме. При скрещивании вCatДEx3 животных с мышами, имеющими в геноме Wnt -репортер bat-gal, было показано, что на стадии E5.5 ряд клеток эпибласта содержит транскрипционно активный в-катенин, тогда как у эмбрионов дикого типа такие клетки появляются только на стадии E6.5. Преждевременная экспрессия маркерных генов мезодермы, snai 1, brachyury и потеря E-кадгерина на стадии E6.5 говорит о том, что клетки эпибласта претерпевают ЭМП раньше срока. В мутантных эмбрионах отсутствовала мРНК hex, являющегося маркером дистальной висцеральной эндодермы, участвующий в образовании передне-задней оси зародыша. При агрегации с морулами мышей линии ROSA26 (экспрессирующими в-галактозидазу) клетки мутантных эмбрионов предпочтительно заселяли висцеральную эндодерму, мезодерму и экстраэмбриональные ткани, но не отмечались в эмбриональной эктодерме. При пересадке под капсулу почки клетки мутантных эмбрионов не образовывали характерных тератом и тератокарцином, состоящих из фрагментов тканей различных типов и недифференцированных клеток. Вместо этого они образовывали трубчатые структуры, состоящие из клеток неправильной формы, некоторые из которых имели ядерную локализацию бета-катенина (Kemler et al., 2004).

В другом исследовании конструкцию zp3-cre использовали для удаления E-кадгерина (De Vries et al., 2004). Исследовали роль бета-катенин- и E-кадгеринзависимой адгезии и Wnt-сигнального пути в ходе раннего эмбрионального развития. Экспрессия ДN бета-катенина приводила к тому, что при удалении Zona pellucida клетки диссоциировали, но экспрессия отцовского аллеля начиная с 4—6-клеточной стадии устраняла дефект адгезии. При отсутствии функционального E-кадгерина отцовский аллель начинал экспрессироваться на стадии морулы. Хотя в отсутствие функционального E-кадгерина бета-катенин обнаруживался в цитоплазме и ядре, это не приводило к какому-либо заметному изменению фенотипа клеток, которое можно было бы ожидать, учитывая ядерные коактиваторные функции бета-катенина. Если ядерный бета-катенин не приводил к существенному изменению фенотипа, можно предположить, что Wnt-сигналинг в ядре не функционирует на ранних стадиях развития. Воздействие ингибитора протеасом MG132 приводило к увеличению уровня бета-катенина в клетках, не экспрессирующих E-кадгерин, а это означает, что механизм протеасомной деградации функционирует на ранних стадиях развития (De Vries et al., 2004).

Приведенные данные говорят в пользу того, что на ранних этапах развития, включая стадию бластоцисты, из которой получают мЭСК, в-катенин либо не локализуется в ядре, либо не выполняет ожидаемой функции (активации транскрипции в-катенин—TCF—респонсивных генов). Выше уже было сказано, что активация Wnt—в-катенинового пути с помощью ингибитора киназы GSK3в (BIO), по некоторым данным, способствует поддержанию плюрипотентного состояния мЭСК в отсутствие фактора LIF (Sato et al., 2004). Подавление активности GSK3в приводит к стабилизации в-катенина, его транспорту в ядро и активации транскрипции генов-мишеней, в частности регуляторов клеточного цикла c-myc и циклинаD1. Известно, что дерегуляция Wnt-пути происходит в опухолях разного происхождения (Fukuchi et al., 1998; Sparks et al., 1998; Koch et al., 1999), а кроме того, активация этого пути характерна для пролиферирующих клеток-предшественников тканей (Reya et al., 2003; He et al., 2004). Было показано, что добавление BIO в среду культивирования ЭСК мыши и человека позволяет сохранять их недифференцированное состояние, что подтверждается как экспрессией соответствующих маркеров (Oct-4 и Nanog), так и сохранением потенциала к дифференцировке в клетках, культивируемых в присутствии BIO (Sato et al., 2004). Активация Wnt-пути после воздействия BIO подтверждалась в этой работе активацией репортерной конструкции TopFlash, содержащей сайты связывания транскрипционных факторов LEF/TCF. На линии ЭСК человека с помощью иммунофлуоресценции показали, что обработка BIO, так же как и лигандом Wnt-пути (Wnt3a), приводит к ядерной локализации бета-катенина, однако на мЭСК этого показано не было (Sato et al., 2004). Эксперименты, проведенные нами, показывают, что в недифференцированных мЭСК бета-катенин располагается возле мембраны, но не в ядрах клеток. Более того, обработка мЭСК BIO не приводит к накоплению бета-катенина в ядре, хотя вызывает значительные изменения морфологии колоний мЭСК. После обработки BIO колонии мЭСК имеют недифференцированный фенотип, округленную форму, клетки в колониях расположены более плотно друг к другу. Вероятно, примембранная локализация бета-катенина характерна для мЭСК и, по-видимому, свидетельствует о необходимости адгезионных контактов для поддержания клеток в недифференцированном состоянии.

Межклеточные контакты, опосредованные E-кадгерином, бета-катенином и плакоглобином, необходимы для компактизации морулы (Ozawa et al., 1989) и, вероятно, играют важную роль в сохранении недифференцированного состояния мЭСК. Известно, что в адгезионной культуре мЭСК предпочитают расти колониями, а при росте в суспензии клетки агрегируют, образуя эмбриоидные тела (Smith, 2001). Вероятно, межклеточные контакты влияют и на способность мЭСК дифференцироваться. Так, плотность культуры определяет эффективность дифференцировки мЭСК в нейроны (Otero et al., 2004). Возможность, в мЭСК Wnt-сигнальный путь функционирует иначе, чем в соматических клетках. В одной из работ, исследующих профиль экспрессии генов в ЭСК мыши и человека, было показано, что в ЭСК не экспрессируется ключевой компонент деградации бета-катенина — белок APC (Wei et al., 2005). Однако данные других работ не согласуются с этими результатами (Kielman et al., 2002; De Vries et al., 2004). Считается, что ядерная локализация бета-катенина в мЭСК может быть необходима для нейрональной дифференцировки, вызванной ретиноевой кислотой. Обработка Wnt3a, экспрессия стабилизированного бета-катенина или доминантно-негативного E-кадгерина способствовали нейрональной дифференцировке (Otero et al., 2004).

Таким образом, данные литературы в большей степени указывают на то, что ядерная (сигнальная) функция бета-катенина не важна для поддержания недифференцированного состояния мЭСК и внутренней клеточной массы бластоцисты. В ходе эмбрионального развития активация Wnt-пути необходима на более поздних этапах, например для реализации ЭМП при образовании клеток первичной мезодермы. В настоящее время остаются невыясненными механизмы, регулирующие функцию бета -катенина в мЭСК, сигнальные пути, регулирующие его взаимодействие с белками межклеточной адгезии, а также направляющие в-катенин на деградацию. Также остается неясным, какие коактиваторы ядерной функции бета-катенина присутствуют в мЭСК.