Вызываемых энтеробактериями 15 страница

Таблица 51

ЭТАЛОННЫЕ КОЛИЦИНОГЕННЫЕ ШТАММЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

КОЛИЦИНОВАРОВ ШИГЕЛЛ P. FREDERIQ)

┌────────────────────────────────┬───────────────────────────────┐

│ Наименование штамма │ Продуцируемый колицин │

├────────────────────────────────┼───────────────────────────────┤

│E. coli CA-18 │B │

│E. coli CA-23 │D │

│E. coli CA-38 │E+I │

│E. coli CA-42 │Y │

│E. coli CA-53 │I │

│E. coli K-235 │K │

│E. coli CA-62 │J+I │

│E. coli CA-7 │V │

│S. boydii P-1 │S │

│ │ I │

│S. boydii P-9 │S +I │

│ │ 3 │

│B. dispar P-14 │S │

│ │ 5 │

└────────────────────────────────┴───────────────────────────────┘

Через 16 - 20 часов инкубации при 37 °C вокруг макроколонии эталонных штаммов во 2-ом слое агара образуются зоны задержки роста испытуемого штамма, если он колициночувствителен. Штамм считают чувствительным, если величина зоны задержки его роста, измеряемой от края макроколонии эталонного колициногенного штамма до наружного края зоны, составляет 2 мм.

При оценке результатов учитывают степень чувствительности к колицинам по системе 4 полюсов: зона до 2 мм "+", от 2 до 5 мм "++", от 4 до 10 мм "+++" и более 10 мм "++++". Для получения четких результатов имеет значение использование правильно приготовленной агаровой среды, особенно в отношения количественного содержания в среде агара (1,5%), в более плотной среде диффузия колицинов в агар замедляется. Важно также обеспечить равномерное распределение инокулята во 2-ом слое (полужидкого) агара.

Изучение спектра лизиса проводят в обеих чашках, если он однороден, типирование считают законченным. При расхождении результатов исследование повторяют. Дублированное исполнение процедур по колицинотипированию диктуется необходимостью исключения технических погрешностей, могущих влиять на спектр чувствительности к колицинам исследуемого штамма.

Установленный колициновар отражает спектр колицинов, к которым исследуемый штамм оказался чувствительным (табл. 51).

4.6. Другие методы типирования

В качестве эпидемиологических маркеров может быть использована и нередко используется характеристика чувствительности штаммов энтеробактерий к различным антибактериальным лекарственным препаратам и в первую очередь к антибиотикам.

В этом случае маркером служит спектр антибиотикорезистентности.

Обычно у штаммов, происходящих от эпидемиологически связанных случаев, спектры резистентности оказываются сходными. Достаточно успешным этот метод маркирования может оказаться при расшифровке вспышек заболеваний, вызванных энтеробактериями, в особенности, если другие методы определения эпидемиологических маркеров не дают желаемого результата.

Вместе с тем следует учитывать, что этот метод маркировки не всегда достаточно надежен вследствие возможности генетического обмена у энтеробактерий факторами, контролирующими резистентность, и соответственно возможности изменения антибиотикограмм.

Тем не менее, систематическое слежение за чувствительностью выделяемых энтеробактерий на той или иной территории имеет важное не только эпидемиологическое, но и клиническое значение.

Установление антибиотикограммы проводят с помощью известных методов определения чувствительности выделенной культуры к антибиотикам, в числе которых наиболее приемлемым для использования в практических условиях является метод диффузии в агар с применением набора коммерческих стандартных дисков с антибиотиками <*>.

--------------------------------

<*> См. "Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агаре с использованием дисков", МЗ СССР, 1983.

5. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ

И БАКТЕРИОНОСИТЕЛЬСТВА

С целью улучшения диагностики заболеваний, вызываемых энтеробактериями, а также при проведении эпидемиологического анализа и выявления источников инфекции следует применять серологические исследования и, в частности, определять в сыворотке крови антитела к антигенам соответствующих возбудителей. Наибольшее значение серологические исследования приобрели в диагностике брюшного тифа, паратифов и других сальмонеллезов, в меньшей степени - при дизентерии. В случае выделения УПЭ серологические исследования могут также иметь определенное значение при оценке этиологической роли выделенных микробов.

Необходимо учитывать, что наиболее специфичным и чувствительным методом титрования антител является реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА). Для постановки РПГА с целью выявления антител к O-антигенам возбудителей брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии применяют коммерческие стабильные эритроцитарные диагностикумы. При отсутствии эритроцитарных O-диагностикумов, а также для выявления H-антител применяют реакцию агглютинации (типа Видаля) с соответствующими коммерческими O- и H-диагностикумами <*>. Для серологической диагностики инфекций, вызываемых УПЭ (Esherichia, Yersinia, Citrobacter, Proteus и др.), коммерческие препараты не выпускают, поэтому реакцию агглютинации ставят с аутоштаммами.

--------------------------------

<*> См. "Каталог препаратов для диагностики бактериальных инфекций", М., 1981.

При постановке любой из указанных серологических реакций следует учитывать одно принципиально важное обстоятельство. Человеческий организм в течение жизни многократно встречается с различными энтеробактериями и их антигенами, поэтому в крови многих практически здоровых людей могут присутствовать (иногда в значительных титрах) антитела к этим антигенам. Вследствие этого понятие "диагностический" титр определяемых антител носит лишь весьма условный ориентировочный характер. Следует учитывать и то, что для разных районов страны (в связи с особенностями эпидемической ситуации и др.) величина "диагностического" титра будет различной. Ее устанавливают в результате титрования сывороток от 100 - 200 здоровых лиц. Существенно большее диагностическое значение имеет нарастание уровня антител в динамике заболевания, для чего сыворотку нужно брать сразу после выявления больного, а затем - в конце первой или в начале второй недели болезни. В более поздние сроки заболевания титр антител к специфическому антигену снижается, что также может служить диагностическим признаком.

Значительную помощь для постановки более обоснованного диагноза оказывает определение не только общего (суммарного) титра антител без дифференциации их на классы иммуноглобулинов, но и антител, относящихся к классу иммуноглобулинов G (IgG). Нормальные (так называемые неспецифические), анамнестические и прививочные антитела, особенно к O-антигенам бактерий, принадлежат в основном к иммуноглобулину M (IgM) и могут содержаться в довольно высоком титре у многих здоровых людей.

Определение относительного содержания в сыворотках IgG-антител основано на том, что эти антитела устойчивы к обработке некоторыми редуцирующими веществами и, в частности, цистеином, тогда как IgG-антитела инактивируются этими реагентами.

5.1. РПГА в диагностике брюшного тифа,

паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии

Кровь берут с соблюдением правил асептики из пальца с помощью оспопрививательных игл или шприцом из вены в стерильную пробирку. После образования сгустка его отделяют от стенок стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой и ставят пробирку в холодильник. Не позднее чем через 24 часа после взятия крови отсасывают сыворотку. Если сыворотка содержит примесь эритроцитов, ее центрифугируют.

Для постановки РПГА удобно использовать пластмассовые планшеты с лунками <*>, в которых готовят последовательные двукратные разведения исследуемых сывороток. С этой целью вначале в лунки планшета наливают по 0,5 мл ИХН. Отдельно разводят в 50 раз исследуемую сыворотку (например, 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл ИХН), 0,5 мл сыворотки в этом разведении вносят в первую лунку. Содержимое лунки тщательно перемешивают градуированной пипеткой и 0,5 мл переносят во вторую лунку, а из второй после перемешивания - в третью и т.д. Обычно достаточно таким способом приготовить ряд из 5 - 6 разведений (до разведения 1:1600 - 1:3200). Из последней лунки 0,5 мл содержимого выливают и вносят во все лунки чистой пипеткой по 0,25 мл необходимого эритроцитарного диагностикума, ампулу с которым перед этим тщательно взбалтывают до полного исчезновения осадка эритроцитов. С целью экономии диагностикумов их можно вносить по 3 капли (не по 0,25 мл, а по 0,15 мл). Пластины осторожно несколько раз встряхивают до получения гомогенной взвеси эритроцитов и ставят на 2 - 3 часа в термостат при 37 °C или на ночь при комнатной температуре, после чего учитывают результат.

--------------------------------

<*> ТУ 64-2-273-79.

Контролями диагностикума служат: 1) постановка реакции со стандартной иммунной сывороткой, вложенной в каждую упаковку диагностикума, - реакция должна быть положительной до разведения, указанного на ампуле с сывороткой; 2) постановка реакции с 0,5 мл ИХН в 2-х лунках - реакция должна быть отрицательной.

Реакция гемагглютинации считается положительной в том случае, если эритроциты полностью агглютинировались и расположены равномерно по дну лунки либо наряду с равномерно расположенными набольшая часть эритроцитов оседает в центре лунки в виде ровного колечка или "пуговки". Иногда при положительной реакции края агглютината в лунках могут слегка оползать, и он принимает вид "зонтика". При отрицательном результате агглютината нет, а эритроциты оседают в центре лунки в виде "пуговки" или ровного колечка.

При необходимости определения IgG-антител следует использовать L- или DL-цистеин как солянокислый, так и "свободный". Препарат должен быть чистым и содержать золу в виде сульфатов не более 0,2%, аммиак - не более 0,05%. Этим требованиям отвечает венгерский цистеин. Непосредственно перед обработкой сывороток готовят раствор цистеина (7 мг на 1 мл растворителя - для L-цистеина и 20 мг - для DL-цистеина). При этом солянокислый цистеин растворяют в 0,1 N растворе едкого натрия с таким расчетом, чтобы pH готового раствора был равен 7,0 - 7,2. "Свободный" цистеин сначала растворяют в половинном количестве ИХН, затем доводят pH до 7,0 - 7,2 0,1 N раствором едкого натрия и вновь доливают до нужного объема ИХН, т.к. "свободный" цистеин значительно слабее, чем солянокислый, сдвигает pH раствора в кислую сторону. Допустимо использование отечественного цистеина, который предварительно должен быть проверен, причем эталоном может служить венгерский или другой проверенный цистеин. С целью проверки pH применяют индикаторную бумагу. Раствор цистеина не может храниться длительное время, поэтому следует вначале приготовить необходимое разведение сыворотки.

Исследуемую сыворотку в разведении 1:5 смешивают с равным объемом цистеина, помещают в небольшие пробирки или флаконы и плотно закрывают их резиновыми пробками (лейкопластырем). Объем пробирок (флаконов) должен быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное свободное пространство во избежание инактивации цистеина кислородом воздуха. Пробирки с сыворотками, обработанными цистеином, выдерживают в течение 18 - 20 часов в термостате при 37 °C. В таких же условиях выдерживают вторую часть исследуемой сыворотки (без цистеина), разведанную 1:10 с применением ИХН. На следующий день обе части сыворотки титруют, начиная с разведения 1:20. В качестве основы для титрования сывороток, обработанных цистеином, необходимо использовать забуференный ИХН (фосфатный буфер, pH 7,0 - 7,2), однако предпочтительней готовить ИХН на нормальной, прогретой при 56 °C в течение 30 минут сыворотке (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100 - 200 мл ИХН (pH 7,0 - 7,2) при условии, что в принятом разведении нормальной сыворотки отсутствуют антитела к применяемым диагностикумам. Это проверяют предварительно для каждой новой серии нормальной сыворотки.

С целью диагностики брюшного тифа и паратифов сыворотки следует титровать с помощью O-диагностикумов серогрупп A, B и D, а также H-диагностикумов I фазы a, b, d и Vi-диагностикума. Четкое нарастание в динамике болезни титра суммарных антител к определенным антигенам и особенно увеличение уровня IgG-антител, устойчивых к цистеину, дает веские основания для подтверждения клинического диагноза. Необходимо учитывать, что при паратифе A титры O-антител на протяжении заболевания могут быть ниже, чем при брюшном тифе и паратифе B.

В случае позднего поступления больного в стационар (в разгар болезни) условно диагностическим титром суммарных O- и H-антител следует считать положительный результат в разведении не ниже 1:640, а для Vi-антител - 1:80 - 1:100. Минимальным условно диагностическим титром IgG O- и H-антител считают разведение 1:80, а для IgG Vi-антител - 1:40 (при паратифе A диагностические титры могут быть в 2 раза ниже).

При позднем серологическом обследовании больного и отсутствии бактериологического подтверждения диагноза целесообразно исследовать сыворотку в периоде реконвалесценции, чтобы выявить снижение общего титра антител и уменьшение удельного содержания цистеинустойчивых IgG-антител, что также может помочь поставить правильный диагноз.

С целью диагностики сальмонеллезов сыворотки вначале титруют

комплексным диагкостикумом (серогрупп A, B, C, C, D и E). При нарастании

1 2

уровня антител или достаточно высоком титре (для взрослых - не ниже 1:400,

для детей до полугода - 1:100, для детей от 6 мес. до 1 года - 1:200)

следует повторить исследование сыворотки со всеми групповыми

O-диагностикумами и поставить РПГА с цистеиновой пробой. Это необходимо для

уточнения этиологии заболевания и потому, что комплексный диагностикум

недостаточно специфичен. Условно диагностическим титром суммарных антител

считают положительный результат реакции в разведении 1:400, а

цистеинустойчивых IgG-антител - 1:80 (для детей до 1 года - 1:20).

С целью диагностики дизентерии сыворотки титруют с эритроцитарными диагностикумами Флекснера (из S. flexneri 1 - 5), Зонне (из S. sonnei), Ньюкасл (из S. flexneri 6), Григорьева - Шига (из S. dysenteriae 1) и Штуцера - Шмитца (из S. dysenteriae 2). Минимальным условно диагностическим титром к диагностикуму Флекснера для взрослых считают положительный результат реакции в разведении 1:400, для детей до 3 лет - 1:100, старше 3 лет - 1:200; для остальных диагностикумов - 1:200. В связи с большим числом неспецифических положительных результатов этой реакции, в особенности в отношении диагностикумов Флекснера и Зонне, достоверным положительным результатом следует считать не менее чем четырехкратное нарастание титра в динамике заболевания, а также наличие титра цистеинустойчивых антител 1:80 и выше.

РПГА с цистеином может оказаться полезной для постановки правильного диагноза в случаях смешанной инфекции и при выделении двух или нескольких представителей энтеробактерий, этиологическая роль каждого из которых не ясна. При истинной микст-инфекции антитела и особенно цистеинустойчивые будут нарастать к каждому из предполагаемых возбудителей. Если же к какому-то из предполагаемых возбудителей нарастание антител, а в том числе IgG, не будет выявлено и при этом отсутствуют клинические симптомы заболевания, то можно считать, что выделение возбудителя носит случайный, транзиторный характер.

В случае формирования острого и особенно затяжного бактерионосительства (при брюшном тифе, паратифах, реже при сальмонеллезах и другие инфекциях) характерно выраженное нарастание IgG-антител, при этом основное значение имеет не абсолютный титр антител, а относительное содержание в сыворотке цистеинустойчивых антител. Если обработка цистеином не снижает титр либо снижает его только на одно, максимум на два разведения, это свидетельствует о значительном содержании в сыворотке IgG-антител, у такого обследованного следует заподозрить острое или хроническое бактерионосительство (при отсутствии клинических проявлений). При длительном бактерионосительстве титр O-антител может быть и низким (иногда 1:20 - 1:40), но эти антитела практически целиком определяются IgG-антителами. Для хронических носителей тифозных бактерий характерны довольно высокие титры Vi-антител (в большинстве случаев выше 1:80) и H-антител (1:320 и выше), которые почти не снижаются при обработке цистеином.

Отмеченная закономерность может нарушаться у хронических носителей тифозных бактерий, инвазированных описторхами. Это необходимо принимать во внимание при обследовании населения территорий, на которых распространен описторхоз.

РПГА с цистеином может быть применена с целью контроля прекращения бактерионосительства. Если на фоне прекратившегося бактериовыделения значительно снизится титр антител и особенно цистеинустойчивых IgG, то можно предположить, что произошло освобождение организма от возбудителя. Прекращение бактерионосительства чаще наблюдается при дизентерии, сальмонеллезах, значительно реже - при брюшном тифе.

Для транзиторных бактерионосителей характерен невысокий титр антител, обусловленный IgM. Если после обработки цистеином в сыворотке остаются IgG-антитела в титре 1:40 и выше, то у такого лица можно предполагать наличие либо субклинической формы инфекции, либо продолжающееся бактерионосительство.

Некоторое повышение титра IgG-антител может происходить в результате многократной специфической вакцинации, поэтому при анализе результатов реакции следует учитывать прививочный анамнез.

При выдаче ответа указывают: "Реакция гемагглютинации с диагностикумом ___________________ отрицательная"; "Реакция гемагглютинации с диагиостикумом ___________________ положительная до титра _________"; "Реакция гемагглютинации с цистеиновой пробой с диагиостикумом _______________ отрицательная"; "Реакция гемагглютинации с цистеиновой пробой с диагиостикумом ________________ положительная до титра ____________".

5.2. Реакция агглютинации с бактериальными диагностикумами

при диагностике брюшного тифа, паратифов,

других сальмонеллезов и дизентерии

Исследуемые сыворотки разводят тем же способом, что и для РПГА, только в пробирках. В каждый ряд агглютинационных пробирок с разведениями сыворотки и в контрольную (с 0,5 мл ИХН) добавляет по 2 капле соответствующего диагностикума, штатив с пробирками несколько раз встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на ночь. Учет результатов реакции рекомендуется проводить с помощью агглютиноскопа, осторожно встряхивая осадок или медленно наклоняя пробирку. При положительной реакции осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его часто бывают неровные (форма "зонтика"). Надосадочная жидкость прозрачна. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадочной жидкости всплывают хлопья или зерна агглютината. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдают хорошо выраженную агглютинацию, считают ее титром. При отрицательной реакции взвесь сохраняет исходную мутность так же, как в контроле диагностикума.

Условно диагностическим титром считают положительный результат реакции агглютинации с брюшнотифозными и другими сальмонеллезными диагностикумами в разведении 1:200, с диагностикумами Флекснера - 1:400, Зонна, Ньюкасл, Григорьева - Шига, Штуцера - Шмитц - 1:100.

Необходимо, однако, помнить, что эти титры не могут служить достоверным доказательством заболевания. Значительно более надежными следует считать увеличение титров в динамике болезни.

В ответе указывают: "Реакция агглютинации с диагностикумом ______________ отрицательная"; "Реакция агглютинации с диагностикумом _________________ положительная до титра ______________".

5.3. Реакция агглютинации с аутоштаммами в диагностике

заболеваний, вызываемых условно патогенными энтеробактериями

Диагностическая ценность этой реакции в значительной мере связана с выявлением характера антителообразования в динамике заболевания. Оптимальные сроки взятия сыворотки 1 - 2, 7 - 10, 14 - 15-й дни заболевания. Полученные от больного сыворотки следует сохранять в холодильнике и исследовать одномоментно ("парные сыворотки"). При специфическом иммунном ответе в конце первой - начале второй недели болезни титр антител нарастает не менее чем в 4 раза, а затем постепенно снижается.

При выделении подвижных культур, представителей родов Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Enterobacter, Proteus и др. сыворотку больных исследуют на H- и O-антитела.

Для H-агглютинации культуры выращивают на свежескошенном СПА в течение 18 часов, затем смывают ИХН и доводят взвесь бактерий до густоты 1 млрд./мл. В ряду из 5 обычных агглютинационных пробирок с 0,25 мл ИХН титруют исследуемую сыворотку, начиная с разведения 1:50, после чего вносят в каждую пробирку, включая одну контрольную с 0,25 мл ИХН, по 0,25 мл приготовленной бактериальной взвеси. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на ночь. Учитывают реакцию, осторожно покачивая пробирку. Агглютинат имеет вид хлопьев. При невозможности взятия сывороток в динамике болезни ориентировочным титром считают положительный результат реакции H-агглютинации в разведении 1:100 - 1:200.

Для O-агглютинации используют взвесь убитой кипячением суточной агаровой культуры бактерий густотой в 3 млрд./мл ИХН.

Перед постановкой реакции бактериальную взвесь необходимо 2 - 3 раза отмыть путем центрифугирования. Исследуемую сыворотку титруют в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10 на ИХН в серологических пробирках. В каждую пробирку, включая контрольную, вносят по 1 капле приготовленной бактериальной взвеси, штатив встряхивают и помещают в термостат при 37 °C на ночь. В случае положительной реакции O-агглютинат при осторожном встряхивании имеет мелкозернистый характер. При невозможности обследования больного в динамике и получении лишь одной сыворотки позже 5 дня болезни условно диагностическим титром считают положительную реакцию в разведении 1:20 и выше.

В ответе указывают: "Реакция агглютинации с аутоштаммом ________________ отрицательная"; "Реакция агглютинации с аутоштаммом __________________ положительная до титра _____________________".