Вызываемых энтеробактериями 11 страница

а) Оригинальная пропись:

Состав: Калий нитрат (KNO) - 0,2 г

Пептон - 5 г

Вода дистиллированная - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют, смешивают, устанавливают pH 7,4,

разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 121 °C 15 минут.

б) Модификация:

Состав: Калий нитрат (KNO) - 0,1 г

Пептонная вода (0,5-процентная) - 1000 мл

Натрий хлорид (NaCl) - 2,5 г

Приготовление: 1-процентную пептонную воду разводят вдвое

дистиллированной водой, прибавляют хлорид натрия, вносят нитрат калия, все

ингредиенты растворяют и хорошо перемешивают, фильтруют через бумажный

фильтр, устанавливают pH 7,1 - 7,2, разливают в пробирки по 5 мл и

стерилизуют при 112 °C 30 минут.

Примечание: нитрат калия (KNO) должен быть свободен от нитритов

(KNO).

Реактив для реакции с метиловым красным

Состав: Метиловый красный - 0,1 г

Спирт этиловый 96° - 300 мл

Вода дистиллированная - 200 мл

Приготовление: краску растворяют в спирте, затем добавляют воду до 500 мл.

Реактивы для реакции Фогеса - Проскауэра

1. 6-процентный раствор альфа-нафтола

Состав: альфа-нафтол - 30 г

Спирт этиловый 96° - 500 мл

2. 40-процентный раствор KOH

Состав: Гидроокись калия (KOH) - 120 г

Вода дистиллированная - 300 мл

Реактив Эрлиха на индол

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 1 г

Спирт этиловый 96° - 95 мл

Кислота хлористоводородная (HCl) концентрированная - 20 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте и добавить кислоту. Хранить в темном месте.

Реактив Ковача на индол

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 5 г

Спирт амиловый - 75 мл

Хлористоводородная кислота (HCl), концентрированная - 25 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте при нагревании (в водяной бане при 50 - 55 °C). Остудить и добавить кислоту. Реактив должен быть желтого цвета. Хранить при 4 °C.

Индикаторные бумажки для определения индола <*>

--------------------------------

<*> Индикаторные бумажки можно приготовить, используя реактив Ковача или Эрлиха.

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид - 5 г

Ортофосфорная кислота (H PO), очищенная,

3 4

концентрированная - 10 мл

Спирт метиловый - 50 мл

Вместо метилового можно использовать этиловый спирт 96° в том же количестве.

Приготовление: в тепловатом растворе ингредиентов смачивают фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре и нарезают полосками (0,5 х 6 см). Цвет бумажек желтый. Хранить в банке темного стекла.

Реактив для определения редукции нитратов

Раствор А. Состав: Сульфониловая кислота - 8 г

Уксусная кислота (5 N раствор) - 1000 мл

Раствор Б. Состав: альфа-нафтиламин - 5 г

или

Диметил-альфа-нафтиламин - 6 г

Уксусная кислота (5 N раствор) - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют при слабом нагревании. Реактивы токсичны, требуют соответствующего обращения. Хранить их необходимо в склянках темного стекла с притертыми пробками при 4 °C. Срок годности реагентов 2 - 3 месяца (при периодическом контроле на известных тест-штаммах).

Реактивы для определения цитохромоксидазы

Раствор А. Состав: Спирт этиловый 95° - 100 мл

альфа-нафтол - 1 г

Диметил-пара-фенилендиамин гидрохлорид - 1 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Примечание: раствор А можно хранить в холодильнике до 10 дней, а раствор Б - только один день.

Реактивы для окраски бактерий по Граму

Реактив I (для первичной окраски)

Состав: Генцианвиолет или кристаллвиолет - 1 г

Спирт этиловый 96° - 10 мл

Фенол - 2 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Приготовление: в ступке растворяют краситель с фенолом, постепенно добавляя спирт и воду, сливают во флакон, выдерживают сутки и затем фильтруют через бумажный фильтр.

Реактив 2. Раствор Люголя (в модификации Грама)

Состав: Калий йодид (KI) - 2 г

Йод кристаллический - 1 г

Вода дистиллированная - 300 мл

Приготовление: йод и йодид калия растворяют в 10 мл воды, оставляют на сутки в мерной колбе, после чего добавляют воду до 300 мл.

Реактив 3. Спирт этиловый 96°

Реактив 4. Фуксин карболовый, разведенный

Состав: а) Фуксин основной - 10 г

Спирт этиловый 96° - 100 мл

Ингредиенты смешивают и ставят в хорошо закрытом флаконе в термостат на

18 - 20 часов.

б) Фенол - 5 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Приготовление: 10 мл спиртового раствора основного фуксина (а) добавляют к 100 мл 5-процентного водного раствора фенола (б), получается крепкий карболовый фуксин, который для работы разводят дистиллированной водой 1:10.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Для усовершенствования методов эпидемиологического обследования и анализа при инфекциях, вызываемых энтеробактериями, характеризующихся большой сложностью и многообразием форм проявления эпидемического процесса, особое значение имеет внутривидовая (внутрисероваровая) дифференциация возбудителей - их эпидемиологическое маркирование.

В основу дифференциации (определения эпидмаркеров) могут быть положены различные свойства микроорганизмов, характеризующиеся стабильностью: биохимические свойства (биовары), антигенная структура (серовары), чувствительность к бактериофагам (фаговары), колициногенная активность (колициногеновары) или чувствительность к колицинам (колициновары), присутствие в штаммах факторов устойчивости к химиотерапевтическим препаратам (R-плазмид определенного типа) и др. У отдельных возбудителей возможно определение ряда эпидмаркеров.

4.1. Определение сероваров у некоторых условно-патогенных

энтеробактерий

Определение сероваров цитробактеров

Определение сероваров возможно у C. freundii при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (таб. 34).

Таблица 34

АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ

РОДА CITROBACTER

┌──────┬────────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐

│O- │ O-антигенный │ H-антиген │

│группа│ комплекс │ │

├──────┼────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │

├──────┼────────────────┼─────────────────────────────────────────────────┤

│01 │1a, 1b, 1c, 1 │1, 2; 14, 15, 16; 21, 25, 26; 21, 25, 27; 39 │

│02 │2b, 1b │1, 2, 4, 5, 6; 7, 8, 10; 8, 10, 11; 14, 15, 16; │

│ │ │13, 17; 21, 22; 23, 28; 32, 34; 35, 37; 39 │

│03 │3a, 3b и 1c │4, 5; 5, 6; 7, 8, 10; 8; 8, 9; 9, 13, 14; 14, │

│ │ │15, 16; 13, 17; 21, 22; 21, 23; 21, 24; 21, 25; │

│ │ │27, 9, 29, 30; 9, 29, 31; 32, 33; 32, 34; 39; │

│ │ │47; 90 │

│04 │4a, 4b │4, 5; 5, 6; 7, 8, 10; 9, 13, 14; 13, 18, 19; 19, │

│ │ │20; 9, 29, 30; 9, 29, 31; 32, 34; 44, 45; 44, │

│ │ │46; 95 │

│05 │5a, 5b, 4b │53, 54; 63, 73; - │

│06 │6, 4b, 5b │72; 54 │

│07 │7, 3b, 1c, │4, 5; 7, 8, 10; 8, 9; 9, 13, 14; 21, 22; 21, 23; │

│ │ │21, 25, 27; 32, 33, 39; 68 │

│ │8a, 1 │1, 2; 5, 6; 8, 12; 9, 13, 14; 9, 13, 15; 21, 22; │

│ │ │21, 25, 27; 9, 29, 30; 32, 33; 39, 53, 55; 67 │

│08 │8a, 8b │1, 2; 8, 12; 9, 13, 14; 21, 25, 26; 21, 25, 27; │

│ │ │35; 37 │

│ │8a, 8c │5, 6; 9, 13, 14; 13, 17; 21, 25, 27; 32, 33; 35, │

│ │ │37; 76 │

│09 │9a, 9b │1, 2; 2, 3; 4, 5; 8, 9; 13, 17; 21, 25, 26; 32, │

│ │ │33; 32, 34; 39, 48 │

│010 │10, 9b │13, 17; 9, 29, 30; 48; - │

│011 │11 │9, 13, 14; 14, 15, 16; 32, 33; 35, 37; 35, 36; │

│ │ │38; 77, 78; 83 │

│012 │12a, 12b │5, 6; 13, 17; 35, 36; 57; 9, 29, 31; │

│ │12a, 12c │62, 57 │

│013 │13 │5, 6; 59; 65; 66; 69 │

│014 │14 │40, 41; 61 │

│015 │15 │13, 18, 19; 21, 22; 32, 34 │

│016 │16 │21, 24; 58 │

│017 │17 │21, 24; 44, 45; 75 │

│018 │18 │56 │

│019 │19 │14, 15, 16; 87; 74 │

│020 │20 │40, 41, 3 │

│021 │21a, 21b │60; 9, 29, 31; 40, 41; 44, 45; 53, 54; 21, 24 │

│022 │22 │64 │

│023 │23 │52; 41, 97 │

│024 │24 │49, 51; 85 │

│025 │25 │35, 36, 38 │

│026 │26 │49, 50; 59 │

│027 │27 │40, 41 │

│028 │28, 1c │70 │

│029 │29 │8, 10, 11; 40, 42; 74; 75; 77, 78; 77, 79; 77, │

│ │ │80; 77, 88; 82; 83; 84; 85; 96; 87; - │

│030 │30, 21b │76; 35, 37; 89 │

│031 │31 │71 │

│032 │32 │23, 28 │

│033 │33 │87 │

│034 │34 │68 │

│035 │35 │91 │

│036 │36 │35, 36; 54, 78 │

│037 │37 │1, 5 <*> │

│038 │38 │92 │

│039 │39 │61; 94 │

│040 │40 │76 │

│041 │41 │98 │

│042 │42 │68; 98 │

└──────┴────────────────┴─────────────────────────────────────────────────┘

--------------------------------

<*> H-антиген, идентичный H-1,5 сальмонелл.

Первоначально культуру испытывают поливалентными O-сыворотками: CiOA, CiOB, CiOC, CiOD, CiOG, каждая из которых включает антитела к ряду O-групп. Например, CiOA содержит антитела к группам 01, 02, 03, 04, 05, 06, 08; CiOB - 09, 010, 011, 012, 013, 014 и т.д. (см. "Наставление по применению O-сывороток для идентификации бактерий Цитробактер").

При работе с поливалентными сыворотками целесообразно начинать с сывороток CiOA, CiOB, CiOF в связи с большей частотой распространения в стране представителей соответствующих серогрупп. При положительном результате реакции агглютинации с одной из поливалентных сывороток продолжают серологическую идентификацию культур с сыворотками к O-антигенам, входящим в состав поливалентной смеси. При наличии положительной реакции агглютинации с одной из указанных сывороток устанавливают серологическую O-группу штамма. При агглютинации культуры одновременно с двумя или тремя поливалентными O-сыворотками, содержащими общие антитела, культуру дополнительно испытывают с соответствующими факторными сыворотками и на основании полученных данных определяют антигенное строение штамма. После установления O-группы определяют H-антиген с использованием поливалентных и моновалентных H-сывороток. Для определения O- и H-антигена в реакции агглютинации на стекле используют 18 - 20-часовую культуру, на СПА проводят реакцию общепринятым способом.

Определение сероваров протеев

Определение сероваров возможно P. vulgaris и P. mirabilis при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (табл. 35) и "Наставлением по применению агглютинирующих диагностических протейных O- и H-сывороток". Для реакции агглютинации применяют суточную культуру на СПА, которую испытывают вначале с поливалентными, а затем при положительной реакции агглютинации с моновалентными O-сыворотками, входящими в поливалентную. После установления O-группы определяют H-антиген, применяя вначале поливалентные, а затем моновалентные H-сыворотки.

Таблица 35

СОКРАЩЕННАЯ АНТИГЕННО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ СХЕМА

P. VULGARIS И P. MIRABILIS

┌────────────┬─────────────────┬───────────────┬─────────────────┐

│ O-антиген │ H-антиген │ O-антиген │ H-антитен │

│ (O-группа) │ │ (O-группа) │ │

├────────────┼─────────────────┼───────────────┼─────────────────┤

│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │

├────────────┼─────────────────┼───────────────┼─────────────────┤

│1 │1 │26 │2; 3; 6 │

│2 │1 │27 │2; 3 │

│3 │1; 2 │28 │1; 3 │

│4 │1; 8; 16 │29 │13 │

│5 │1; 3 │30 │1; 2; 4; 13; 15 │

│6 │1; 2; 3 │31 │1; 2 │

│7 │1; 3; 4 │32 │1; 3; 5 │

│8 │1 │33 │3 │

│9 │1; 2 │34 │6 │

│10 │1; 2; 3; 4; 5 │35 │2 │

│11 │1; 2; 3; 6 │36 │3; 7 │

│12 │1; 2 │37 │17 │

│13 │1; 2; 3; 4 │38 │1; 2 │

│14 │1; 3 │39 │18 │

│15 │1; 7 │40 │4 │

│16 │1; 9; 14 │41 │1; 2 │

│17 │1; 10 │42 │1 │

│18 │1 │43 │2 │

│19 │1; 3; 11 │44 │11; 19 │

│20 │1; 2 │45 │11 │

│21 │1 │46 │17 │

│22 │1 │47 │1 │

│23 │1; 2; 3; 12 │48 │1 │

│24 │1; 3; 4; 13 │49 │2 │

│25 │1 │ │ │

└────────────┴─────────────────┴───────────────┴─────────────────┘

При отсутствии диагностических H-сывороток и необходимости выяснения однородности выделенных штаммов протея по H-антигену (при выявлении источника инфекции и др.) используют феномен Динеса.

Для выявления феномена Динеса хорошо подсушенную чашку с 2-процентным СПА делят пополам, на каждую половину среды (на полюсах диаметра чашки) засевают по одной капле 4 - 5-часовой бульонной культуры. Чашки с посевами помещают при 37 °C на 18 - 20 часов или оставляют на тот же срок при комнатной температуре, после чего учитывают результаты. При наличии двух идентичных по H-антигену штаммов отмечают слияние зон роста в результате роения. При различных H-антигенах между обоими участками образуется разграничительная (демаркационная) зона шириной в 0,5 - 2 мм.

Разработана антигенно-диагностическая схема P. inconstans (Providencia), но производственный выпуск агглютинирующих сывороток отсутствует.

Определение сероваров у клебсиелл (K. pneumoniae) <*>

--------------------------------

<*> Выпуск коммерческих K-сывороток предполагается в ближайшее время.

Установление сероваров клебсиелл проводят путем определения капсульного (K) антигена в реакции агглютинации на стекле при помощи капсульных K-сывороток. Для получения культуры в капсульной форме исследуемый штамм пассируют через углеводосодержащие среды (0,2-процентный глюкозный бульон и агаровая среда Ворфеля - Фергюсона). Культуру засевают в 0,2-процентный глюкозный бульон и инкубируют в течение 4 час. при 37 °C, после чего пересевают на среду Ворфеля - Фергюсона и инкубируют при той же температуре 18 - 20 часов.

Для реакции агглютинации петлю агаровой культуры со среды Ворфеля - Фергюсона растирают на предметном стекле рядом с каплей соответствующей капсульной клебсиеллезной сыворотки, после чего их тщательно смешивают. Капсульная агглютинация наступает обычно очень быстро и имеет вид крупных хлопьев, тяжей или с трудом разделяемого диска. В сомнительных случаях реакция может наблюдаться в нескольких сыворотках при нахождении культуры в OK- или BK-формах, результат подтверждают в развернутой (пробирочной) реакции агглютинации в разведениях сыворотки 1:2, 1:4. <*>

--------------------------------

<*> Проведение реакции агглютинации и отбор культур в К-форме осуществляют в соответствии с "Наставлением по применению клебсиеллезных диагностических агглютинирующих сывороток".

Положительный результат этой реакции оценивают по появлению дискообразного плотного агглютината, всплывающего в виде "зонтика" при встряхивании пробирки, разбиваемого с трудом на крупные хлопья.

Определение серогрупп иерсиний

Определение серогрупп проводят в реакции агглютинации на стекле или в пробирках с кроличьими сыворотками с высокими титрами антител против соответствующих сероваров. Вид Y. pseudotuberculosis включает шесть O-групп, но наиболее часто регистрируемыми являются I и затем III и IV O-серогруппы. В связи с этим используют в первую очередь сыворотку против серогруппы O-I. В случае отрицательного результата используют сыворотки против O-серогрупп III и IV и затем II, V и VI серогрупп этих микробов.

Серологическую идентификацию Y. enterocolitica так же, как и псевдотуберкулезного микроба, начинают с использования сыворотки против наиболее распространенных серогрупп 03 и 09, затем 05.27, 08, 06 и других, которые могут встретиться у человека (табл. 36).

Таблица 36

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ИЕРСИНИЙ

┌─────────────────────┬───────────────────────────────────────────┬───────┐

│ Вид иерсиний │ Серогруппы │Биовары│

│ ├───────────────────────────┬───────────────┤ │

│ │ Регистрируемые при │ Не │ │

│ │ заболевании человека │регистрируемые │ │

│ ├─────────┬─────┬───────────┤ │ │

│ │постоянно│редко│в единичных│ │ │

│ │ │ │ случаях │ │ │

├─────────────────────┼─────────┼─────┼───────────┼───────────────┼───────┤

│T. enterocolitica │08 │06.30│010, 013.7,│04.32; 06.31; │1 │

│ │ │ │014 │07.8; 015; 018;│ │

│ │ │ │ │19.8; 020; 021;│ │

│ │ │ │ │022 │ │

│ │09 │- │- │- │2 │

│ │05.27 │- │- │05 │3 │

│ │03 │- │- │- │4 │

│ │- │- │- │- │5 │

├─────────────────────┼─────────┼─────┼───────────┼───────────────┼───────┤

│Y. pseudotubercolosis│I │III │IV, II │V, VI │нет │

└─────────────────────┴─────────┴─────┴───────────┴───────────────┴───────┘

Из табл. 36 видно, что по принадлежности к тому или иному биовару (см. последнюю графу табл. 36) возможно предположить принадлежность штамма к той или иной O-серогруппе. Все штаммы Y. enterocolitica серогруппы 03 относятся к 4 биовару, 08 и 06 - к 1-му и 09 - ко 2-му, штаммы серогруппы 05.27 относятся к 3 биовару.

4.2. Определение биоваров

Определение биоваров шигелл

Антигенная однородность S. sonnei и S. flexneri 6 исключает их серологическую дифференциацию, поэтому дальнейшее их разделение на биовары осуществляют при использовании жидких сред с углеводами.

Неодинаковая биохимическая активность по отношению к отдельным углеводам некоторых сероваров шигелл других видов также может быть использована для дифференциации их на биовары.

Определение биоваров S. sonnei

Дифференциация S. sonnei основана на их неодинаковой биохимической активности в отношении рамнозы, ксилозы и мальтозы, что позволяет подразделять их на 7 стабильных биоваров (табл. 37). <*>

--------------------------------

<*> Определение биоваров проводят в соответствии с "Методическими материалами по биохимическому типированию шигелл Зонне" (МЗ СССР, 1971).

Таблица 37

БИОВАРЫ S. SONNEI

┌───────────┬─────────────┬─────────────────┬────────────────────┐

│ Биовар │ Рамноза │ Ксилоза │ Мальтоза │

├───────────┼─────────────┼─────────────────┼────────────────────┤

│Ia │+ (1) │- │+ (1 - 2) │

│IIb │+ (1) │- │+ (> 2) │

│IIg │+ (> 1) │- │+ (1 - 2) │

│IIe │+ (> 1) │- │+ (> 2) │

│IIId │+ (1) │+ (1) │+ (1 - 2) │

│IIIc │+ (1) │+ (1) │+ (> 2) │

│IVf │+ (1) │+ (2 и позже) │+ (1 и позже) │

└───────────┴─────────────┴─────────────────┴────────────────────┘