Вызываемых энтеробактериями 14 страница

Обозначения: CL - сливной лизис; SCL - полусливной лизис; "+++" - отдельные негативные колонии (более 20); "++" - отдельные негативные колонии (до 20); "+/-" - единичные колонии; "-" - отсутствие лизиса.

Штаммы фаговара A лизируются всеми Vi II-фагами. Подразделение фаговара на подфаговары в группах B, C, D, E и т.д. построено таким образом, что штаммы подфаговара с порядковым номером 1 (B1, C1, D1, E1 и т.д.) лизируются не только гомологичным фагом, но и всеми другими фагами данной группы.

Для штаммов некоторых фаговаров (B1, B2, B3, C) характерна чувствительность к ряду фагов, в т.ч. и неродственных групп.

Для проведения этого исследования суточную агаровую культуру изучаемого штамма (после проверки на содержание в ней Vi-антигена с помощью Vi-сыворотки) пересевают в пробирку с 2 - 3 мл мартеновского или хоттингеровского бульона (pH 7,0 - 7,2) и инкубируют в термостате при 37 °C 3 - 4 час. Молодую бульонную культуру вносят в чашку Петри с 25 - 30 мл 1,5 - 1,7-процентного СПА, хорошо подсушенного. Чашки с агаром готовят накануне, оставляя их в термостате с закрытыми крышками, а на следующий день подсушивают с открытыми крышками в течение 20 - 30 мин. Культуру наносят на агар в чашке петлей (диаметром 5 мм) или тонко оттянутой пастеровской пипеткой в виде отдельных капель. Число капель культуры должно быть на 3 единицы больше числа используемых бактериофагов: одну из них испытывают с Vi I-фагом, вторую с O-поливалентным сальмонеллезным фагом и третья капля служит контролем культуры (вместо фага на нее наносят каплю бульона). Культуру можно засеять на чашку в виде сплошного газона, на который после подсыхания наносят петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой Vi II-бактериофаги в тест-разведениях, а также Vi I- и O-фаги. После подсыхания капель фага чашки оставляют в термостате при 37° C и учитывают результаты дважды (через 5 - 6 час. и 18 - 20 час.). Учет проводят невооруженным глазом или с помощью 5-кратной лупы через дно чашки в проходящем свете. Фаговар культуры определяют в соответствии с указанной схемой. При определении фаговаров возможны результаты, отклоняющиеся от указанных в схеме: а) культура лизируется Vi-фагом, но нечувствительна ни к одному из Vi II-бактериофагов. Причина этого: выделение штамма, к которому Vi II-фаги еще не открыты или отсутствуют в используемом наборе; изучаемый штамм относится к тем культурам, к которым Vi II-бактериофаги не могут быть адаптированы (Vi I-штаммы); б) культура содержит Vi-антиген, лизируется несколькими Vi II-фагами, но спектр лизиса не соответствует ни одному из представленных в схеме (полилизабельные, деградированные штаммы), для их успешного исследования рекомендуется изучить несколько колоний (2 - 4), т.к. некоторые из них могут сохранять признаки определенного фаговара. Нередко полилизабельные культуры проявляют выраженную однотипность в спектре чувствительности к Vi II-бактериофагам, что может быть использовано как эпидемиологическая метка при выделении таких штаммов от разных лиц или других источников; в) культуры, не обладающие Vi-антигеном, хорошо лизирующиеся O-фагом и не чувствительные ни к одному из Vi-фагов, обозначают как W-форму.

Определение фаговаров S. paratyphi B

Для определения фаговаров S. paratyphi B используют международную стандартную схему Феликса и Келлоу (10 фагов), дополненную 5 фагами <*>. С помощью этой схемы удается установить 10 основных фаговаров S. paratyphi B и 19 их постоянных подфаговаров. Определение фаговаров S. paratyphi B основано на определении спектра лизиса несколькими фагами. Методика определения фаговаров та же, что для S. typhi, однако для S. paratyphi B делают две дополнительные капли культуры (одна для испытания с O-фагом, другая для контроля культуры).

--------------------------------

<*> Выпускаются Тбилисским научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток.

Таблица 48

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОВАРОВ S. PARATYPHI B

┌──────────┬──────────────────────────────────────────────┬───────────────────────┐

│ Фаговары │ Бактериофаги │ │

│ штаммов ├──┬──┬────┬───┬────┬────┬─────┬────┬────┬─────┼──┬──┬──┬───┬───┬──────┤

│ │1 │2 │ 3a │3b │Yer-│Bec-│Taun-│BAOR│Dun-│Work-│c │d │e │ f │ h │Приме-│

│ │ │ │ │ │sey │cles│ton │ │dee │sop │ │ │ │ │ │чание │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │<*> │

├──────────┼──┼──┼────┼───┼────┼────┼─────┼────┼────┼─────┼──┼──┼──┼───┼───┼──────┤

│1 │CL│L │+++ │+ │CL │- │- │- │OL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(1) │

│1 var.1 │CL│CL│++++│- │CL │SCL │SCL │+++ │SCL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(1) │

│1 var.1 │CL│CL│++++│+++│CL │SCL │SCL │++++│SCL │- │CL│CL│CL│SCL│SCL│(Q) │

│2 │- │CL│- │- │+ │- │- │- │CL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(2) │

│2 var.1 │- │CL│- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │CL│CL│- │SCL│SCL│(2) │

│3a │- │- │CL │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+++ │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a │- │- │CL │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+++ │CL│CL│- │SCL│SCL│(S) │

│3a var.2 │- │- │CL │SCL│- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a 1 │- │- │CL │- │- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a 1 │- │- │CL │- │- │- │- │- │- │- │CL│- │CL│- │SCL│(W) │

│3a 1 │- │- │CL │- │- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│CL│CL │SCL│(Q) │

│3a 1 var.1│- │- │CL │- │- │SCL │SCL │/OL/│SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│3a 1 var.1│- │- │CL │- │- │SCL │SCL │/OL/│SCL │- │CL│CL│CL│SCL│SCL│(Q) │

│3b │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+ │- │CL│- │- │SCL│(A) │

│3b │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+ │CL│CL│- │- │SCL│(BT) │

│3b │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│SCL │+ │- │CL│CL│- │SCL│(P) │

│3b var.1 │- │- │- │SCL│- │SCL │SCL │/OL/│- │- │CL│- │CL│- │SCL│(M) │

│Yersey │- │- │- │- │OL │SCL │SCL │/OL/│SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(Y) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(A) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(BT) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │- │CL│CL│- │SCL│P │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │- │SCL │- │CL│CL│- │- │- │(BM) │

│Beccles │- │- │- │- │- │SCL │SCL │/OL/│- │- │CL│- │CL│- │SCL│(W) │

│var.1 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Taunton │- │- │- │- │- │- │SCL │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│Taunton │- │- │- │- │- │- │- │- │SCL │- │CL│CL│- │- │SCL│(B) │

│(Dundee) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│BAOR │- │- │- │+ │- │- │- │OL │- │- │CL│- │CL│- │SCL│(W) │

│BAOR │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │CL│- │CL│- │SCL│(M) │

│(н.т.) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Dundee │- │- │- │- │- │- │- │- │SCL │- │- │CL│- │- │SCL│(A) │

│Worksop │- │- │- │- │- │- │- │- │- │SCL │- │- │- │- │- │(-) │

└──────────┴──┴──┴────┴───┴────┴────┴─────┴────┴────┴─────┴──┴──┴──┴───┴───┴──────┘

--------------------------------

<*> Обозначения фаговаров по спектру реакций штаммов с типовыми бактериофагами Тбилисского НИИВС - c, d, e, f, h.

Обозначения: CL - сливной лизис; SCL - полусливной лизис; OL - лизис со вторичным ростом; /OL/ - непостоянная реакция; "++++" - отдельные негативные колонии (более 20); "+++" - отдельные негативные колонии (до 20); "+" - единичные негативные колонии; "-" - отсутствие лизиса.

Определение фаговара культуры проводят в соответствии с приведенной схемой (табл. 48), используя соответствующие фаги. Следует иметь в виду, что изучаемый штамм может отклоняться от указанных в схеме спектров лизиса, например, не лизироваться ни одним из типовых бактериофагов (его обозначают как отрицательный) либо лизироваться несколькими фагами, не укладываясь в установленные схемой фаговары (его обозначают как нетипируемый).

Определение фаговаров S. paratyphi A

Определение фаговара S. paratyphi A осуществляют в соответствии с международной схемой, включающей 6 специфических бактериофагов, с помощью которых удается установить 6 фаговаров этих бактерий, обозначаемых арабскими цифрами 1, 2, 3, 4, 5, 6 (табл. 49).

Таблица 49

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОВАРОВ S. PARATYPHI A

┌──────────────┬───────┬────────┬────────┬───────┬───────┬───────┐

│ \ Типовые│ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │

│ \ фаги │ │ │ │ │ │ │

│Фаговары \ │ │ │ │ │ │ │

├──────────────┼───────┼────────┼────────┼───────┼───────┼───────┤

│1 │CL │CL │CL │CL │CL │CL │

│2 │- │CL │- │- │- │CL │

│3 │- │- │CL │- │- │- │

│4 │++ │++ │- │CL │+++ │- │

│5 │- │- │- │- │CL │- │

│6 │- │- │- │- │- │CL │

└──────────────┴───────┴────────┴────────┴───────┴───────┴───────┘

Обозначения: CL - сливной лизис; "+++" - отдельные негативные колонии (более 10); "++" - отдельные негативные колонии (менее 10); "-" - отсутствие лизиса.

Установление фаговара основано на определении четких спектров лизиса изучаемых штаммов S. paratyphi A бактериофагами определенных типов (фаговары 3, 5 и 6) или группами фагов (фаговары 1, 2 и 4).

Методика определения фаговаров та же, что для S. typhi и S. paratyphi B. Следует отметить, что наибольший успех при определении фаговара S. paratyphi A (равно как при определении фаговара S. paratyphi B) достигается в том случае, если изучению подвергается не одна, а несколько (2 - 4) культур, полученных из отдельных колоний исследуемого штамма.

4.4. Типирование шигелл по колициногенной активности <*>

--------------------------------

<*> См. "Методические материалы по внутривидовому типированию дизентерийных бактерий Зонне по колициногенности и колициночувствительности". МЗ СССР, 1971.

Метод определения колициногенной активности у шигелл основан на свойстве этих бактерий продуцировать колицины с неодинаковым спектром действия на индикаторные бактерии.

Принятый в нашей стране метод определения колициногеноваров у S. sonnei предусматривает использование 10 индикаторных штаммов (8 штаммов S. sonnei, S. dysenteriae 2 и одного - E. coli) из набора Эббота и Шеннона. С их помощью могут быть установлены 17 колициногеноваров (табл. 50). Еще 5 индикаторных штаммов (S. sonnei) из упомянутого набора применяют для уточнения характеристик, если результаты определения колициногеновара по основной схеме вызывают сомнения или необходимость их подтвердить.

Таблица 50

СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЦИНОГЕННОЙ

АКТИВНОСТИ S. SONNEI ПО ЭББОТУ И ШЕННОНУ

(В МОДИФИКАЦИИ Н.А. СМИРНОВОЙ-МУТУШЕВОЙ, 1968)

┌───────┬────────────────────────────────────────────────────────┐

│Коли- │ Индикаторные штаммы <*> │

│цино- ├─────────────────────────────────┬──────────────────────┤

│геновар│ Для постоянного │ Для уточнения │

│(услов-│ пользования │ характеристик │

│ный) ├──┬──┬──┬──┬──┬────┬──┬──┬───┬───┼───┬────┬────┬────┬───┤

│ │31│32│33│37│39│8218│41│42│43 │44 │34 │ 35 │ 36 │ 38 │40 │

├───────┼──┼──┼──┼──┼──┼────┼──┼──┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼───┤

│ 1 │2 │3 │4 │5 │6 │ 7 │8 │9 │10 │11 │12 │ 13 │ 14 │ 15 │16 │

├───────┼──┼──┼──┼──┼──┼────┼──┼──┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼───┤

│1A │+ │+ │+ │+ │- │+ │- │- │- │- │- │- │+ │- │- │

│1B │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │

│2 │- │+ │+ │- │+ │- │- │- │- │+ │- │- │- │- │- │

│3 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │

│3A │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │+ │+ │

│4 │+ │+ │+ │- │+ │- │+ │+ │- │+ │X │+ │- │+ │+ │

│5 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │X │+ │+ │+ │+ │

│6 │- │+ │- │+ │+ │- │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │

│7 │- │- │+ │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │

│8 │+ │- │+ │- │- │- │- │+ │- │+ │- │+ │- │+ │- │

│9 │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │+ │- │+ │- │X │+ │+ │- │

│10 │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │- │+ │- │+ │+ │+ │- │

│11 │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │- │

│12 │+ │+ │- │+ │+ │- │- │+ │- │+ │- │+ │+ │+ │- │

│13 │- │+ │+ │+ │+ │- │- │- │- │+ │- │- │+ │- │- │

│14 │+ │+ │+ │+ │+ │- │- │+ │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │

│15 │+ │- │+ │- │- │- │+ │+ │+ │+ │+ │+ │- │+ │+ │

└───────┴──┴──┴──┴──┴──┴────┴──┴──┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴───┘

--------------------------------

<*> Условные обозначения индикаторных штаммов соответствуют следующим наименованиям оригинальных штаммов: 31 - S. sonnei 2; 32 - S. sonnei 56; 33 - S. sonnei 17; 37 - S. sonnei 56/98; 39 - S. sonnei R6; 8218 - S. dysenteriae 2 N 19; 41 - S. sonnei 3/64; 42 - S. sonnei 2/15; 43 - S. sonnei R5; 44 - E. coli K-12 ROW; 34 - S. sonnei 2M; 35 - S. sonnei 38; 36 - S. sonnei 56/56; 38 - S. sonnei RT; 40 - S. sonnei 2/7.

Обозначения: "+" - торможение роста; "-" - отсутствие торможения; X - вариабельные результаты.

Исследование проводят способом перекрестных посевов. Для этого суточную бульонную культуру исследуемого штамма сеют на агаровую пластинчатую среду в виде двух параллельных полос, располагающихся по обе стороны предполагаемой линии диаметра чашки таким образом, чтобы расстояние между полосами посева составляло 3 - 4 см. В качестве питательной среды (в чашках) применяют коммерческий питательней агар "Д" или приготовленный в лаборатории 1,5-процентный СПА на гидролизате Хоттингера с конечным содержанием аминного азота в среде 130 - 150 мг и pH 7,4. С целью предотвращения роста воздушной флоры к агару добавляют раствор генцианвиолета (2 - 4 капли 0,1-процентного водного раствора на 100 мл среды), известно также, что он стимулирует колицинопродукцию.

Чашки с указанными посевами инкубируют при 37 °C в течение 48 часов. Этот срок необходим для накопления в среде колицинов в концентрации, достаточной для проявления их действия на индикаторные штаммы. После инкубации в крышку чашки наливают 0,5 мл хлороформа и закрывают ее второй половиной той же чашки (с выросшей культурой), выдерживая экспозицию 40 - 50 мин. Обезвреженную культуру снимают узким краем стерильного предметного стекла, стараясь сохранить целостность агаровой поверхности; далее под прямым углом к линиям посева исследуемого штамма на агар наносят бактериологической петлей 4-х часовые бульонные культуры индикаторных штаммов в виде поперечных полос. Посевы делают таким образом, чтобы полосы посевов на одной половине чашки помещались против интервалов между полосами посевов на другой половине чашки. Рекомендуется постоянно соблюдать однотипный порядок расположения посевов индикаторных штаммов, что позволяет не делать специальные пометки на чашках. При использовании 10 или 15 индикаторных штаммов соответственно делают на каждой половине чашки 6 и 4 или 8 и 7 полос.

Чашки с посевами индикаторных штаммов инкубируют при 37 °C 18 - 20 часов. При учете результатов прежде всего необходимо установить, является ли исследуемый штамм колициногенным. Показателем колициногенности является торможение роста индикаторного штамма 44 (E. coli K-12 ROW), чувствительного ко всем известным колицинам, кроме колициногеновара 7 типа (к нему чувствителен штамм 33). Наряду с этим может иметь место торможение роста еще каких-либо индикаторных штаммов.

При изучении спектра зон задержки положительным результатом считают наличие зоны торможения роста индикаторных бактерий более 4 мм. Сопоставляя полученные результаты со схемой (табл. 50) устанавливают условный колициногеновар. Однако литический спектр может не соответствовать ни одному из условных колициногеноваров. Такие штаммы обозначают как нетипируемые.

При применении метода колициногенотипирования необходимо проводить периодический контроль за стабильностью свойств индикаторных штаммов с помощью набора стандартных колициногенных штаммов.

4.5. Типирование шигелл по чувствительности к колицинам

Чувствительность S. sonnei и других видов шигелл к колицинам (колициновар) связано со способностью бактерий адсорбировать на рецепторах поверхности клетки определенные колицины; колицины (или группа родственных колицинов) адсорбируются на строго специфических рецепторах.

Этот метод применяют к разным видам шигелл (в целом занимающих одно из первых мест по чувствительности к колицинам среди всех родов энтеробактерий), т.к. они мало отличаются по удельному весу колициночувствительных штаммов. Вместе с тем использование этого метода в эпидемиологических целях ограничено из-за относительной нестабильности колициноваров.

Для определения колициноваров используют 11 эталонных колициногенных штаммов из коллекции P. Frederiq. Перечень их представлен в таблице 51. Перед началом исследования готовят чашки с 1,5-процентным СПА, разливая его по 20 - 25 мл на чашку с добавлением генцианвиолета (2 - 4 капли 0,1-процентного водного раствора на 100 мл среды). Определение проводят в двух (дублирующих) чашках. Дно каждой чашки со средой разделяют на 11 квадратов - по числу эталонных штаммов, обозначая их условно 1, 2, 3 и т.д. соответственно порядковому номеру при использовании этих штаммов. В квадраты сеют последовательно уколом петли суточные бульонные культуры указанного набора колициногенных штаммов. Чашки с посевами инкубируют при 37 °C в течение 22 - 24 часов, затем обеззараживают однократно хлороформом, как было описано выше (удаление обезвреженной бактериальной массы не требуется). По окончании этой процедуры 2 капли 6-часовой бульонной культуры исследуемого штамма вносят в пробирку с 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 46 - 48 °C полужидкого (0,7%) СПА и после перемешивания агар наслаивают на 1-й слой агара. В результате предшествовавшего культивирования посевов эталонных колициногенных штаммов в толще 1-го слоя агара колицины диффундировали в среду вокруг макроколоний.