Вызываемых энтеробактериями 4 страница

│Hafnia │Полупрозрачные, бесцветные или имеющие оттенок │ │

│ │среды, розоватые, сероватые; на среде Плоскирева │ │

│ │дают скудный рост и нередко напоминают колонии │ │

│ │шигелл │ │

├────────────┼─────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Serratia │Бесцветные, по размеру и форме трудно отличимые │На СПА колонии многих │

│ │от колоний шигелл или сальмонелл │штаммов продуцируют пиг-│

│ │ │мент розового, красного │

│ │ │или фуксинового цвета │

├────────────┼────────────────┬────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Proteus │2 - 3 мм в диа- │P. vulgaris, P. mirabilis, │На ВСА через 48 часов │

│ │метре, прозрач- │проявляя способность роения, │роста колонии влажные, │

│ │ные и полупроз- │дают сливной рост, другие виды │грязно-коричневого │

│ │рачные, слегка │образуют колонии, сходные с │цвета, после их снятия │

│ │выпуклые и с │колониями сальмонелл или шигелл,│на среде остается темно-│

│ │желтовато-розо- │колонии P. inconstans весьма │коричневая редукционная │

│ │вым (перламутро-│сходные с колониями шигелл │зона │

│ │вым) оттенком, │ │ │

│ │вокруг колоний │ │ │

│ │желтоватый ореол│ │ │

├────────────┼────────────────┴────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Edwardsiella│Бесцветные или слегка розоватые (на Эндо), полу- │На ВСА колонии темные, │

│ │прозрачные, сходные с колониями сальмонелл или │без металлического │

│ │шигелл │блеска и почернения │

│ │ │среды под ними; на среде│

│ │ │Эт-2 - малинового цвета │

│ │ │с черным центром │

├────────────┼─────────────────────────────────────────────────┼────────────────────────┤

│Erwinia │При 37 °C не растут или дают замедленный скудный │ │

│ │рост; при 25 - 27 °C (оптимальной температуре │ │

│ │культивирования) колонии с разнообразными харак- │ │

│ │теристиками, более всего сходные с колониями │ │

│ │эшерихий │ │

└────────────┴─────────────────────────────────────────────────┴────────────────────────┘

Для получения количественных показателей обсеменения исследуемого материала УПЭ в случаях их выявления в отсутствие патогенных энтеробактерий и решения вопроса об этиологической значимости могут быть проведены дозированные посевы из проб материала на пластинчатые среды.

Для жидких субстратов (клинический материал) разведения готовят

объемным методом, разводя 0,1 - 1,0 мл исследуемой пробы в соотношении 1:10

-1

(разведение 10) в ИХН. Далее в двух пробирках, содержащих по 9,9 мл того

-3 -5

же раствора, последовательно готовят разведения 10 и 10, перенося по

0,1 субстрата из предыдущего разведения. Всю работу проводят с соблюдением

правил асептики, со сменой градуированных пипеток при переходе от

предыдущего разведения к последующему. При исследовании испражнений

предварительно следует приготовить навеску в пределах от нескольких

дециграмм до одного грамма, разведения готовят, как указано ранее. Для

количественного учета УПЭ на пластинчатые дифференциально-селективные среды

-3 -5

высевают по 0,1 мл из разведений 10 и 10 и тщательно растирают

нанесенный на поверхность среды материал. На последующих этапах при

подсчете выросших колоний их число умножают на соответствующее разведение

(из которого проводили высев на чашку) и на 10, т.к. была высеяна доза 0,1

-3

мл. Например: высев из разведения 10 привел к развитию в чашке 30

колоний, однородных по своим характеристикам и отнесенных к роду

Citrobacter. Для определения содержания их в 1 грамме исследованного

материала 30 умножают на 1000 и на 10 (30 х 1000 х 10 = 300000 = 3 х 10).

Таким образом устанавливают, что в 1 грамме материала содержалось 3 х 10

бактерий рода Citrobacter.

Отобранные для дальнейшего изучения колонии пересевают в одну из сред для первичной идентификации. При целенаправленном исследовании на ЭПЭ первичный отбор колоний (не менее 2 - 3 каждой разновидности) проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки OKA (к большому числу наиболее распространенных сероваров ЭПЭ). Остаток колонии, давшей агглютинацию с указанной сывороткой, отсевают в среду для первичной идентификации и на скошенный агар (для дальнейшего серологического изучения).

2.3. Идентификация энтеробактерий

Идентификация энтеробактерий включает три этапа: а) первичную идентификацию; б) установление рода (дифференциацию родов) и в) идентификацию вида и внутривидовую дифференциацию.

Выполнение первого типа предусматривает определение биохимических признаков изучаемой культуры с использованием сред для первичной идентификации (комбинированных сред), а при необходимости и тестов для дифференциации энтеробактерий от других грамотрицательных бактерий. На втором этапе применяют тесты минимального дифференцирующего ряда в наборе, необходимом для установления рода (дифференциации от сходных родов), а также вида у тех родов энтеробактерий, которые представлены единственным видом. Третий этап идентификации предполагает использование дополнительных биохимических тестов для внутривидовой дифференциации - определение видов, внутривидовую дифференциацию, а при необходимости и наличии соответствующих коммерческих диагностических сывороток и серологическую внутривидовую дифференциацию.

При выделении шигелл, сальмонелл и ЭПЭ три этапа идентификации, а при исследовании с целью выделения других энтеробактерий - первые два этапа идентификации и частично третий этап (до вида) осуществляют все бактериологические лаборатории. Внутривидовую дифференциацию энтеробактерий, не относящихся к шигеллам, сальмонеллам и ЭПЭ, проводят в соответствующих лабораториях (см. "Общее примечание").

2.3.1. Первичная идентификация

Для этой цели применяют, как указывалось, комбинированные среды - Олькеницкого или Клиглера, на которых наряду с получением культуры для дальнейшего изучения выявляют одновременно несколько ее признаков: способность образовывать сероводород и отношение к глюкозе, лактозе (а также сахарозе и мочевине - на среде Олькеницкого). Посев материала из колонии на комбинированную среду проводят бактериологической петлей вначале по скошенной части штрихом и заканчивают уколом в толщу агарового столбика, не достигая дна пробирки. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 - 20 часов, а при целенаправленных исследованиях на иерсинии - в течение того же времени, но при 22° - 25 °C.

О ферментации лактозы (и сахарозы) в среде Олькеницкого и ферментации

лактозы в среде Клиглера судят по появлению желтой окраски в скошенной

части агара, а о ферментации глюкозы - по такому же окрашиванию в столбике.

Газообразование устанавливают по появлению пузырьков, разрывам агара или

его отслоению от стенок пробирки. Образование сероводорода устанавливают по

почернению среды обычно в средней части столбика, при значительной

продукции H S можно наблюдать почернение всей среды. В среде Олькеницкого

при росте культуры, гидролизующей мочевину, происходит подщелачивание,

вследствие чего среда приобретает диффузный яркий красно-малиновый цвет. В

этом случае учет ферментации углеводов невозможен. При интенсивном

образовании сероводорода, когда чернеет целиком вся среда, учет ферментации

углеводов в средах Клиглера и Олькеницкого затруднен. Однако следует

помнить, что образование сероводорода может происходить лишь в кислой

среде, которая создается за счет ферментации глюкозы, присущей всем

энтеробактериям. Кроме того, при просмотре среды в проходящем свете в

столбике обычно видны на общем черном фоне участки пожелтевшего агара,

свидетельствующие о ферментации углеводов.

По совокупности биохимических свойств, выявленных на комбинированной среде, делают предположительное заключение о возможной родовой принадлежности культуры. Далее выбирают дифференциально-диагностические тесты, необходимые для установления рода энтеробактерий, т.е. проводят дифференциацию родов (табл. 5). Для эшерихий, эдвардсиелл, гафний и серраций это совпадает с определением вида.

Таблица 5

ПЕРВИЧНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

ПО БИОХИМИЧЕСКИМ РЕАКЦИЯМ В КОМБИНИРОВАННОЙ СРЕДЕ

И ВЫБОР ТЕСТОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ РОДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ <*>

--------------------------------

<*> Сведения по роду Erwinia не включены, так как при обычном (37 °C) культивировании посевов на пластинчатых средах указанные энтеробактерии не растут или дают замедленный скудный рост.

┌─────────────────────────────────┬──────────────────┬──────────────────────────────────┐

│ Реакция в среде Олькеницкого, │ Предполагаемые │Тесты и субстраты для установления│

│ Клиглера │ энтеробактерии │ рода энтеробактерий │

├────────┬───────┬───────┬────────┤ │ │

│лактоза │глюкоза│серо- │мочевина│ │ │

│и (или) │ │водород│ <***> │ │ │

│сахароза│ │ │ │ │ │

│ <**> │ │ │ │ │ │

├────────┼───────┼───────┼────────┼──────────────────┼──────────────────────────────────┤

│- │к │- │- │Shigella, │Подвижность (при 37° и 22 °C), │

│ │ │ │ │некоторые серовары│индол, натрия ацетат, фенилаланин-│

│ │ │ │ │сальмонелл │дезаминаза, лизиндекарбоксилаза, │

│ │ │ │ │ │мочевина (по Преусу или Кристенсе-│

│ │ │ │ │ │ну), реакция Фогеса - Проскауэра и│

│ │ │ │ │ │проба с метиловым красным (при 22 │

│ │ │ │ │ │°C), пробы с поливалентными │

│ │ │ │ │ │сальмонеллезным и дизентерийным │

│ │ │ │ │ │фагами, серологические пробы с │

│ │ │ │ │ │поливалентными сыворотками к │

│ │ │ │ │ │сальмонеллам и шигеллам │

│- │кг │- │- │S. paratyphi A и │Подвижность (при 37° и 22 °C), │

│ │ │ │ │некоторые другие │индол, натрия ацетат, фенилаланин-│

│ │ │ │ │серовары сальмо- │дезаминаза, лизиндекарбоксилаза, │

│ │ │ │ │нелл, некоторые │реакция Фогеса - Проскауэра и │

│ │ │ │ │биовары │пробы с метиловым красным (при 22 │

│ │ │ │ │S. flexneri 6, │°C), пробы с поливалентными саль- │

│ │ │ │ │Escherichia, │монеллезным и дизентерийным фага- │

│ │ │ │ │Hafnia, │ми, серологические пробы с полива-│

│ │ │ │ │P. inconstans, │лентными сыворотками к сальмонел- │

│ │ │ │ │Serratia │лам и шигеллам │

│- │к │+ │- │S. typhi и некото-│Проба с поливалентным сальмонел- │

│ │ │ │ │рые другие серова-│лезным фагом и поливалентными │

│ │ │ │ │ры сальмонелл │сыворотками к сальмонеллам; см. │

│ │ │ │ │ │тесты для идентификации сероваров │

│- │кг │+ │- │Salmonella, │Индол, сорбит, лизиндекарбоксила- │

│ │ │ │ │Citrobacter, │за, пробы с поливалентным сальмо- │

│ │ │ │ │Edwardsiella │неллезным фагом и поливалентными │

│ │ │ │ │ │сыворотками к сальмонеллам │

│+ │к │- │- │Escherichia, │Цитрат Симонса, мочевина (по │

│ │ │ │ │Citrobacter или не│Преусу или Кристенсену), редукция │

│ │ │ │ │энтеробактерии │нитратов, цитохромоксидаза │

│+ │кг │- │- │Escherichia, │Цитрат Симонса, подвижность, ин- │

│ │ │ │ │Citrobacter, │дол, реакция Фогеса - Проскауэра, │

│ │ │ │ │Klebsiella, │проба с метиловым красным, лизин- │

│ │ │ │ │Enterobacter, │декарбоксилаза, орнитиндекарбокси-│

│ │ │ │ │Serratia │лаза, мочевина (по Преусу или │

│ │ │ │ │ │Кристенсену) │

│+ │кг │+ │- │Citrobacter │См. тесты для идентификации видов │

│. │. │. │+ │Proteus (кроме │Фенилаланиндезаминаза, см. тесты │

│ │ │ │ │P. inconstans), │для идентификации видов │

│ │ │ │ │Yersinia │ │

│. │г │. │+ │Proteus (кроме │См. тесты для идентификации видов │

│ │ │ │ │P. inconstans) │ │

│- │- │- │- │Не энтеробактерии │См. текст к табл. 6 │

│+ │- │- │- │Не энтеробактерии │См. текст к табл. 6 │

└────────┴───────┴───────┴────────┴──────────────────┴──────────────────────────────────┘

--------------------------------

<**> При использовании среды Олькеницкого.

<***> При использовании среды Клиглера проводят параллельный посев в среду с мочевиной (по Преусу или по Кристенсену).

Условные обозначения: "+" - положительная реакция, указывающая на ферментацию лактозы и (или) сахарозы, образование сероводорода, гидролиз мочевины; "-" - отрицательная реакция по тем же тестам; "к" - ферментация глюкозы без газообразования; "кг" - ферментация глюкозы с газообразованием; "." - учет реакции невозможен.

В связи с тем, что набор определяемых с помощью комбинированных сред биохимических признаков не является достаточным для установления рода энтеробактерий, серологическую идентификацию исследуемой культуры на данном этапе не проводят, кроме постановки серологических проб с поливалентными сыворотками к сальмонеллам и шигеллам, помогающих выбору биохимических тестов для дальнейшей идентификации. Исключение возможно при чрезвычайных эпидемических ситуациях, при этом к серологическому исследованию культуры приступают после проведения пересевов с этой среды на необходимые среды минимального дифференцирующего ряда, а полученные результаты серологической идентификации рассматривают как сугубо ориентировочные, требующие подтверждения на этапе завершенной биохимической идентификации.

При возникновении сомнений в принадлежности изучаемой культуры к семейству Enterobacteriaceae (см. табл. 5) следует использовать тесты, позволяющие дифференцировать энтеробактерии от других грамотрицательных микроорганизмов. В числе этих тестов: изучение морфологических (палочка, кокк) и тинкториальных свойств микроорганизмов путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму (+ или -); OF-тест, т.е. тип утилизации глюкозы - окисление (O), ферментация (F) или отсутствие активности (-); определение таких ферментов, как цитохромоксидаза, нитратредуктаза (редукция нитратов в нитриты), см. табл. 6.

Таблица 6

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ОТ НЕКОТОРЫХ ДРУГИХ

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

┌────────────────────┬──────────────────────────────┬───────┬─────────┬─────────┐

│ \ Дифференци- │ Морфология │OF-тест│Цитохром-│Нитрат- │

│ \рующие тесты│ │ │оксидаза │редуктаза│

│Микро- \ │ │ │ │ │

│организмы \ │ │ │ │ │

├────────────────────┼──────────────────────────────┼───────┼─────────┼─────────┤

│Enterobacteriaceae │Небольшие полиморфные палочки;│F │- │+ │

│ │подвижные (перитрихи) или │ │ │ │

│ │неподвижные; без капсулы или с│ │ │ │

│ │капсулами │ │ │ │

│Pseudomonas │Прямые или изогнутые одиночные│O │+ │X │

│ │палочки; подвижные (моно- или │ │ │ │

│ │лофотрихи); без капсул, часто │ │ │ │

│ │образующие пигмент синего, │ │ │ │

│ │зеленого, фиолетового или др. │ │ │ │

│ │цвета │ │ │ │

│Vibrio │Короткие изогнутые или прямые │F │+ │+ │

│ │палочки, одиночные или образу-│ │ │ │

│ │ющие S-образные нити, спирали;│ │ │ │

│ │подвижные (монотрихи), без │ │ │ │

│ │капсул │ │ │ │

│Aeromonas │Прямые палочки с закругленными│F │+ │+ │

│ │концами или кокковидные; рас- │ │ │ │

│ │полагаются поодиночке, парами,│ │ │ │

│ │цепочками; подвижные (монотри-│ │ │ │

│ │хи) или неподвижные │ │ │ │

│Plesiomonas │Прямые палочки, располагаются │F │+ │+ │

│ │поодиночке, парно или цепочка-│ │ │ │

│ │ми; подвижные (лофотрихи) │ │ │ │

│Flavobacterium │Тонкие палочки или кокковидные│O или │+ <**> │X │

│ │формы; подвижные (перитрихи) │-, F │ │ │

│ │или неподвижные <*> │ │ │ │

│Moraxella │Однородные или полиморфные, │- │+ │X │

│ │короткие толстые палочки, │ │ │ │

│ │часто кокковидные; неподвижные│ │ │ │

│Aloaligenes │Одиночные палочки, кокковые │- │+ │X │

│ │или кокковидные формы; │ │ │ │

│ │подвижные (перитрихи) │ │ │ │

│Acinetobacter │Короткие толстые палочки или │O или -│- │- <***> │

│ │кокковидные формы; парно или │ │ │ │

│ │цепочками; неподвижные; без │ │ │ │

│ │капсулы или с капсулами │ │ │ │

└────────────────────┴──────────────────────────────┴───────┴─────────┴─────────┘

--------------------------------

<*> При росте на твердых питательных средах образуют колонии желтого, оранжевого, красного или коричневого цвета; оттенок пигмента зависит от состава среды и температуры культивирования.

<**> Кроме F. meningosepticum, дающих отрицательную реакцию.

<***> За исключением единичных штаммов Acinetobacter calcoaceticum.

Обозначения: "+" - положительная реакция; "-" - отрицательная реакция; X - разные реакции; O - окисление; F - ферментация.

Микроскопию окрашенных по Граму мазков из сомнительных культур следует считать первоочередной, так как при этом могут быть выявлены особенности (например, кокковая форма), исключающие необходимость использования других тестов. Нечеткие результаты окраски по Граму (у некоторых штаммов микроорганизмов родов Acinetobacter, Moraxella и Bacillus) могут быть уточнены при использовании пробы с KOH. Для этого культуру суспендируют в капле 3-процентного раствора KOH на предметном стекле. При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, жидкость в капле становится вязкой, нити тянутся за петлей на 0,5 - 2 см. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.

Для постановки OF-теста изучаемую культуру засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона (одновременно в две пробирки), в одну из которых затем вносят стерильное вазелиновое масло (0,5 - 1 мл). Посевы делают небольшой петлей, не доводя ее до дна пробирки на 5 - 6 мм, инкубируют при 37 °C в течение 1 - 4 суток. Изменение цвета среды на желтый в обеих пробирках указывает на расщепление глюкозы путем ферментации (F), появление желтой окраски среды только в открытой пробирке, не залитой вазелиновым маслом, - об окислительном процессе (O), а сохранение исходного неизменного цвета в обеих пробирках - об отсутствии активности в отношении глюкозы (-).

Тест на цитохромоксидазу можно проводить по методу Эрлиха, для чего на поверхность роста 18 - 20-часовой агаровой культуры наносят каплю 1-процентного водного раствора диметил-пара-фенилендиамина и добавляют каплю 1-процентного спиртового раствора альфа-нафтола. При положительной реакции через 1 - 3 минуты появляется ярко-синее окрашивание. Тест можно воспроизвести также с помощью диска на цитохромоксидазу из коммерческой бумажной индикаторной системы (СИБ) в соответствии с наставлением к нему. Наличие цитохромоксидазы можно выявить по методу Ковача (известен как тест на оксидазу), являющемуся модификацией метода Эрлиха. По методу Ковача на культуру наносят несколько капель 1-процентного водного раствора тетра-пара-фенилендиамина. При положительной реакции через 20 - 30 секунд появляется стойкое темно-красное окрашивание.