II. Методы количественного определения белков

Определение количества белка один из самых распространенных биохимических анализов. Определение концентрации белков в сыворотке крови и серозных жидкостях часто встречается в практике клинических лабораторий. Методы количественного определения белков имеют исключительное значение для фармацевтической промышленности. Количественные определения белков в продуктах питания незаменимы в технологическом контроле и экспертизе качества продуктов питания. В практике научно-исследовательских биохимических лабораторий количественное определение белков проводят при их выделении в чистом виде, исследовании физико-химических свойств и биологической роли белков, контроле биотехнологических процессов, в молекулярной биологии и генетической инженерии.

В современной биохимии количественное определение белков проводят, в основном фотометрическими методами. В основу всех этих методов положена способность молекул белков поглощать свет, либо в нативном (природном) состоянии, либо после проведения соответствующей химической реакции. В результате проведения такой реакции зачастую бесцветные растворы белка приобретают определенную окраску. Примером таких реакций являются ксантопротеиновая и биуретовая реакции. Интенсивность получаемой окраски пропорциональна концентрации белка.

Фотометрические методы основаны на общем законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера, который определяет соотношение между интенсивностью падающего (I₀) и прошедшего через поглощающий раствор (I) излучения:

Величина lg I/I₀ характеризует степень ослабления интенсивности излучения после прохождения через раствор. Её называют оптической плотностью раствора, или его экстинкцией и обозначают буквой А. Данный закон отражает линейную зависимость оптической плотности А от концентрации поглощающего вещества С, толщины поглощающего слоя l, коэффициента поглощения (коэффициента экстинкции) ε. При концентрации раствора 1 моль/литр и толщине поглощающего слоя 1 см этот коэффициент представляет собой коэффициент молярного поглощения. Он является основной характеристикой, отражающей способность вещества поглощать свет. Чем больше величина ε, тем выше чувствительность фотометрического метода определения вещества.

В фотометрическом анализе концентрацию исследуемого вещества определяют по величине оптической плотности исследуемого раствора. При этом оптическую плотность измеряют с помощью инструмента (фотоэлектрического колориметра или спектрофотометра), а величины ε и l заранее известны:

Зачастую в исследуемом растворе, кроме определяемого вещества присутствуют другие соединения, также способные поглощать свет. Известно, что белый свет представляет собой электромагнитные волны с диной от 400 до 700 нм. Различные вещества отличаются друг от друга по способности поглощать свет с разной длинной волны - то есть имеют разные спектры поглощения. Для снижения влияния примесей на фотометрическое определение исследуемого вещества всегда исследуют поглощение света с определенной длинной волны. То есть в анализе всегда измеряют оптическую плотность на определенной длине волны. Это позволяет значительно повысить селективность, чувствительности и точность измерений.

Кроме наличия мешающих соединений в фотометрический анализ могут вносить погрешности процессы рассеяния света на стенках сосуда, в который внесли раствор для измерения оптической плотности. Также, в случае определения белка после проведения химической реакции всегда необходимо учесть эффект от протекания реакции в отсутствие белка и от примесей, находящихся в использованных реактивах.

Данные погрешности можно исключить если из полученных значений оптической плотности пробы вычесть значения оптической плотности пробы полученной в тех же условиях, но без белка. Такая проба носит название холостой пробы а измеряемый раствор – раствора сравнения.

Для точного измерения оптической плотности растворов веществ используются спектрофотометры. Схема работы спектрофотометра приведена на рисунке (рис. 2)

Принцип работы спектрофотометра состоит в следующем. В осветителе (1) инструмента находится источник белого света – лампа (2), и система фокусировка этого света (3). Из осветителя свет попадает в монохроматор (4), в котором происходит разложение света в спектр и вырезание света с определенной длинной волны. Обязательными элементами монохроматора являются входная щель (7), диспергирующий элемент (5) и выходная щель (6). Из монохроматора выходит монохроматический свет (свет с определенной длинной волны). Покинув монохроматор, луч монохроматического света попадает в кюветное отделение (8), где проходи через сосуды (кюветы, 9), заполненные исследуемыми растворами. После прохождения кюветы, свет попадает детектор (10), преобразующий свет в электрический сигнал. Величина электрического сигнала, подаваемого детектором прямо пропорциональна интенсивности падающего света. Полученный электрический сигнал усиливается и передается из блока детектора в блок измерения и вычисления (12). Микропроцессор, находящийся в этом блоке, выводит на экран значение оптической плотности.

Рис. 2. Схема устройства спектрофотометра.

1 – осветитель, 2 – источник света, 3 – конденсор, 4 – монохроматор, 5- диспергирующий элемент, 6 – выходная щель, 7 – входная щель, 8 – кюветное отделение, 9 – кювета с исследуемым раствором, 10 – детектор, 11 – фотоэлемент, 12 – блок измерения и вычисления

В качестве отчета о проделанной работе, для каждого метода приведите:

1. Построенные вами калибровочные графики

2. Определите концентрацию белка, в выданных вам «слепых» растворах