| 1. На дне лунок полистироловой 96-луночной планшеты сорбирован антиген (диагностикум).
| 
|
2. В лунки (в дубли или триплеты) вносят исследуемый материал – сыворотку крови. При наличии антигенспецифических антител она связывается с сорбированным на дне лунки антигеном. То есть иммунный комплекс остаётся фиксирован к дну лунки.[L3] Количество соединившихся с антигеном антител и, соответственно, количество фиксированных иммунных комплексов определяется уровнем антител, содержащихся в исследуемых образцах (А, Б). Если антител в исследуемом образце нет, то антиген остаётся свободным, фиксированные иммунные комплексы не образуются (В).
|
| 3. Для выявления связавшихся с антигеном антител используют конъюгат. Он представляет собой антитела к Fc-фрагменту антител человека определённого класса, ковалентно связанный с ферментом.
| 
|
4. В лунки вносят раствор субстрата для фермента. Систему «фермент–субстрат» подбирают таким образом, чтобы действие фермента по преобразованию субстрата сопровождалось появлением окраски раствора.
|
| 5. Чем больше антител в исследуемом материале, тем больше связалось фермента, тем больше преобразовалось субтрата и тем насыщеннее цвет жидкости в лунке.
|
| | | |
Таким образом, в ИФА создаётся возможность количественного определения антител в исследуемом материале. Для регистрации результатов применяют специальный планшетный спектрофотометр. Для количественного определения уровня антител необходимо использовать стандарт с известным содержанием антител к антигену-диагностикуму. Для избегания неопосредованной взаимодействием антиген–антитело фиксации компонентов ИФА после каждой стадии проводят процедуру отмывания (трижды), внося в каждую лунку 250 мкл отмывающего буфера, и удаляют отмывающий буфер стряхиванием.
