I. Теоретическая часть. Лимфоциты являются особым классом клеток, для которых характерно разноообразие по выполняемым функциям

Лимфоциты являются особым классом клеток, для которых характерно разноообразие по выполняемым функциям, что составляет основу субпопуляционного различия. Между тем, морфологических отличий у лимфоцитов разных субпопуляций практически нет при том, что для лимфоцитов и их субпопуляций характерна определённая степень полиморфизма.

Визуально при микроскопическом исследовании окрашенных препаратов лимфоцитов можно отличить лишь некоторую часть лимфоцитов-натуральных киллеров и плазматические клетки (рис. 7.1).

Рисунок 7.1 Некоторые морфологические особенности лимфоцитов: слева – лимфоцит, посередине – большой гранулярный лимфоцит (NK-лимфоцит), справа – плазматические клетки

В качестве одного из подходов в дифференцировке лимфоцитов по популяциям и субпопуляциям бытовал цитохимический метод, позволяющий отличать клетки по ферментам, присутствующих внутри клетки. Были выявлены ферменты, характерные преимущественно для Т-хелперов и других субпопуляций лимфоцитов. Но, помимо трудоёмкости этого метода, для него характерна и ограниченность получаемой информации: лимфоциты обладают более разнообразными функциями, которые не соотносятся с наличием того или иного, определяемого цитохимически, фермента.

Постепенно в иммунологии формировалось направление, предполагающее исследование и идентификацию мембранных, а позже и внутриклеточных, молекул-маркёров. Это направление получило название «иммунофенотипирование».

Иммунофенотипирование – это установление мембранных маркёров клеток. Мембранные маркёры представляют собой гликопротеиновые, гетеропептидные и др. молекулы, экспрессируемые на цитоплазматической мембране клеток. Мембранные маркёры функционально активны. Каждая такая молекула связывается с соответствующим ей лигандом (свободно циркулирующей молекулы или мембранной молекулой другой клетки). В результате связи мембранного маркёра со своим лигандом клетка изменяет своё функциональное состояние.

Выяснилось, что лимфоциты разных субпопуляций и разного функционального состояния отличаются экспрессией разных маркёров (табл. 7.1).

Таблица 7.1

Маркёры основных популяций и субпопуляций лимфоцитов

Клетки	Маркеры (указаны по системе CD – cluster of designation)
виды	функции
Т-лимфоциты	CD2	Адгезия (лиганд к CD58); участие в активации
CD3	Часть рецепторного ком­плекса TCR - CD3
СD 5	Костимуляция Т-лимфоцитов. ЛигандCD72
СD6	Адгезия, активация Т-лимфоцита
СD7	FcμR. Передача сигнала
CD4/CD8	Корецептор Т-хелперов Лиганд МНС-II
В-лимфоциты	CDI9	Часть корецептора В-лимфоцита
CD 20	Са2+- канал. Регуляция актива­ции В-лимфоцита
CD21	Часть корецептора В-лимфоцита CR2; лиганд C3d, EBV
CD 22	Адгезия В-лимфоцита на Т-лимфоцитах и моноцитах
CD 72	Лиганд CD5. Учас­тие в активации В-лимфоцита
NK-лимфоциты	CD2	Адгезия (лиганд — CD58); участие в активации
CD7	FcμR. Передача сигнала
CD 11b	α-Субъединицы β2-интегринов; b-ICAM-l,iC3b, с- фибриногена
CD11c
CD56	Медиатор цитотоксичности. Адгезия. Изоформа N-CAM
Активированные лимфоциты и моноциты	CD 25	α-Цепь рецептора ИЛ-2
CD 30	Костимуляция[L5]?
CD54	Адгезия; лигандβ2-интегринов
CD 60	NeuAc-NeuAcGal эпитоп гликопротеинов
CD 69	Передача сигнала. Ранний маркер активации
HLA-DR, DQ, DP	Молекулы главного комплекса гистосовместимости
CD 71	Трансферриновый рецептор пролиферирующих клеток

В наши дни иммунофенотипирование осуществляется с помощью моноклональных антител, получаемых на основе особых иммунобиотехнологических методик и специфичных конкретным маркерам. Такие моноклональные антитела при добавлении к суспензии клеток связываются лишь с теми лимфоцитами, которые экспрессируют данный маркер. Для визуализации этого взаимодействия, а значит для отнесения лимфоцита к той или иной субпопуляции, моноклональные антитела ковалентно связывают с флуорохромной меткой (рис. 7.2).

Рисунок 7.2 Маркирование лимфоцитов моноклональными антителами (реакция прямой иммунофлуоресценции, РИФ): к суспензии лимфоцитов добавляют меченные флуорохромоммоноклональныеантитела (МАТ) к определённому маркёру лимфоцитов. Моноклональные антитела связываются только с теми лимфоцитами (в данном случае с А), которые экспрессируют маркёр, соответствующий данному моноклональному антителу. Отмывание суспензии клеток избавляет её от несвязавшихся с клетками антител, и суспензия готова к регистрации результатов с помощью люминесцентного микроскопа (свечение даст только лимфоцит А) или с помощью проточного лазерного цитофлуориметра

Таким образом, результаты реакции (реакции прямой иммунофлуоресценции) регистрируют по световому сигналу, испускаемому клеткой после облучения ее квантами света с определенной длиной волны (длина волны определяется особенностями поглощения флуорохромов). Результаты исследования регистрируют с помощью лазерного проточного цитофлуориметра или люминесцентного микроскопа.

Ранее (до середины 80-х годов 20 века) принадлежность лимфоцитов к той или иной субпопуляции лимфоцитов определяли с помощью реакций розеткообразования. Эти реакции отличаются ограниченными возможностями (можно определить лишь небольшой спектр мембранных маркёров), высокой степенью субъективизма (из-за рутинной регистрации – с помощью обычного светового микроскопа), невысокой воспроизводимостью результатов, а также достаточно трудоемкими процедурами подготовки образцов к исследованию. Поэтому реакции розеткообразования имеют преимущественно историческое значение.

Феномен розеткообразования заключается в адгезии к лимфоциту эритроцитов других видов млекопитающих. Эта адгезия осуществляется вследствие сродства эритроцитов некоторым мембранным рецепторам (маркёрам) лимфоцитов. Если к лимфоциту прикрепилось не менее 3 эритроцитов, то такой лимфоцит относят к розеткообразующим (рис. 7.3).

Рисунок 7.3 Феномен образования розеткообразующей клетки (Е-РОК): суспенизю лимфоцитов (Л) смешали с суспензией эритроцитов (Э) барана. После инкубации микроскопически определяют розеткообразующие клетки, то есть такие лимфоциты, к которым прикрепились не менее 3 эритроцитов

Изначально экспериментальным путем было обнаружено, что Т-лимфоциты способны прикреплять к своей цитоплазматической мембране эритроциты барана. В дальнейшем рецептор к эритроцитам барана был идентифицирован как CD2-маркёр. Таким образом, смешивание лимфоцитарной суспензии с суспензией эритроцитов барана дает возможность отличить Т-лимфоциты, экспрессирующие маркер CD2, а данная реакция получила название реакции Е-розеткообразования (Е – эритроцит). Точнее, реакция Е-розеткообразования позволяет дифференцировать субпопуляцию Е-РОК (розеткообразующих клеток).

Затем было обнаружено, что В-лимфоциты экспрессируют рецептор к С3-компоненту комплемента (по современной классификации это CD21-маркёр). Для его определения (а значит для идентификации субпопуляции В-лимфоцитов) была разработана методика ЕАС-розеткообразования. Данная аббревиатура – «эритроцит – антитело – комплемент» – означает, что на эритроцитах барана или быка создается специальный комплекс. Суспензия эритроцитов обрабатывается антителами к эритроцитам (этот процесс называется сенсибилизацией), а затем – комплементом, получаемым из сыворотки крови морских свинок или других видов животных. Таким образом, эритроцит по сути является антигеном, с которым связывается антитело, а этот комплекс в свою очередь способен запускать классический путь активации системы комплемента. Все ингредиенты этой реакции подбираются таким образом, чтобы активация комплемента не проходила полностью (иначе будет разрушен эритроцит), а лишь способствовала бы фиксации С3 на комплексе антиген–антитело. Дальнейшее смешивание суспензии лимфоцитов с суспензией сенсибилизированных антителами и комплементом эритроцитов дает возможность идентификации ЕАС-РОК, являющихся В-лимфоцитами.

Реакции розеткообразования дают возможность идентификации только части популяции Т-клеток (не все Т-лимфоциты экспрессируют CD2) и части популяции В-лимфоцитов (CD21 является маркером только зрелых В-лимфоцитов). NK-лимфоциты невозможно определить с помощью реакции розеткообразования. Поэтому при начале работ по иммунофенотипированию количество NK-лимфоцитов определяли по отсутствию меркеров, характерных для Т-лимфоцитов (в Е-РОК), и маркеров В-лимфоцитов (в ЕАС-РОК). Эти клетки долгое время обозначали как 0-лимфоциты.