I. Теоретическая часть. Установление концентрации иммуноглобулинов разных классов в биологических жидкостях (сыворотке крови

Установление концентрации иммуноглобулинов разных классов в биологических жидкостях (сыворотке крови, слюне и проч.) имеет важное диагностическое и научное значение. Поэтому для количественного определения концентрации IgG, A, M, E разработаны специальные методы, включая реакцию простой радиальной иммунодиффузии по Манчини.

Эта реакция основана на феномене преципитации, т. е. образовании крупного белкового конгломерата, состоящего из комплексов антиген-антитело, и видимого невооруженным глазом.

Антигеном в данном случае являются собственно иммуноглобулины каждого класса. Так как иммуноглобулины (например, человека) – это белки, то для другого вида животных они являются антигеном и при введении в организм индуцируют гуморальный иммунный ответ с синтезом антител. То есть, иммунизируя иммуноглобулинами человека животных (овец, коз или кроликов), можно получить диагностический компонент – антитела к иммуноглобулинам определенных классов человека. Этот диагностический компонент называется антисывороткой к иммуноглобулину человека определенного класса и выпускается специальными предприятиями и лабораториями.

Данный диагностический компонент (антисыворотку к IgG, например, или к IgA, или к IgM) в определенном количестве (в титре) вносят в агаровый или агарозный гель. Температура геля в этот момент должна быть на уровне +40 – +43°С (при более высокой температуре диагностические антитела коагулируют, а при более низкой гель застывает и введенные диагностические антитела не перемешиваются и не распределяются в геле равномерно). Агаровый гель с внесенной диагностической антисывороткой перемешивают и распределяют эту смесь на стеклянных пластинах. Толщина агарового слоя должна составлять 1 мм.

После застывания в агаровом геле с помощью специального пробойника делают лунки диаметром 1,5–2 мм, в которые вносят исследуемый материал. Исследуемый материал всасывается в агаровый слой. При наличии в исследуемом образце иммуноглобулинов соответствующего класса происходит реакция взаимодействия антиген (иммуноглобулин определяемого класса исследуемого образца) – антитело (диагностическая антисыворотка, или антиIg определенного класса). В последующем, благодаря особенностям строения молекул Ig, возникает укрупнение комплексов за счет объединения нескольких в единый комплекс, т. е. образование преципитатов. Визуально преципитаты видны невооруженным глазом как мутные зоны на фоне более прозрачного агарового слоя (рис. 5.1, А). Для лучшего контрастирования преципитатов пластины окрашивают красителями, связывающимися с белками (рис. 5.1, Б). Площадь преципитата соответствует количеству определяемых Ig. Для количественного определения концентрации иммуноглобулинов какого-либо класса необходимо иметь стандартный образец, содержащий известную концентрацию Ig разных классов. Такие стандартные образцы также выпускаются специальными предприятиями и прилагаются к набору диагностических антисывороток. Стандартный образец вносят в ряд лунок, приготовив предварительно разведения образца для получения концентраций, отличающихся друг от друга в 2 раза. Благодаря этому после диффузии получается ряд преципитатов разной площади, что позволяет построить калибровочный график и определить концентрацию иммуноглобулина в исследуемых образцах.

Рисунок 5.1 Внешний вид преципитатов при постановке реакции Манчини для определения концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови: А – нативный препарат, Б – окрашенные преципитаты, В – методика измерения диаметра преципитата клиновидной линейкой (увеличено).