Проведение реакций иммунофенотипирования лимфоцитов

1. Реакция прямой иммунофлуоресценции

Реакцию проводят на выделенной из крови суспензии мононуклеаров в концентрации 2,5–5,0×10⁶ клеток/мл или с использованием цельной крови.

1. В пластиковую пробирку (12×75 мм) вносят 100 мкл крови, добавляют 10 мкл МАТ, меченных флуорохромом, тщательно перемешивают и инкубируют в темноте при комнатной температуре 30 минут.

2. В образец вносят лизирующий эритроциты раствор (0,84 МNH₄Cl в буферном растворе) на 3–5 минут, затем добавляют 2 мл PBS.

3. Центрифугируют пробирку, отбирают супернатант, а к осадку клеток добавляют 0,5 мл 2%-ного раствора параформальдегида.

4. Регистрируют реакцию на проточном цитофлуориметре.

2. Реакция розеткообразования

Для проведения реакции розеткообразования нужно изолировать суспензию лимфоцитов из периферической крови на градиенте плотности фиколл-верографин.

1. Эритроциты барана отмывают три раза и готовят 0,5%-ную суспензию.

2. В пробирке смешивают в равных объемах суспензию выделенных лимфоцитов (2´10⁶/мл) и эритроцитов барана.

3. Смесь инкубируют при 37ºС 5 минут.

4. Центрифугируют при 1000 об/мин. в течение 5 минут.

5. Инкубируют при 4ºС 60 минут (в холодильнике).

6. Фиксируют смесь путем добавления 0,1 мл 0,8%-ного раствора глютарового альдегида.

7. Из полученной смеси готовят мазки, фиксируют их в метаноле или смеси Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Учет результатов проводится под иммерсионной системой микроскопа с увеличением 10´90.

Подсчитывается количество лимфоцитов, фиксирующих на своей поверхности 3 и более эритроцита (на 200 лимфоцитов). Пересчет их на абсолютное число осуществляется по формуле:

абсолютное количество лейкоцитов ´ % лимфоцитов´ %Е-РОК