Пер­вич­ная струк­ту­ра ДНК

Пред­став­ля­ет со­бой изо­гну­тую спи­раль­ную цепь со­еди­нен­ных ко­ва­лент­ны­ми свя­зя­ми нук­лео­ти­дов.

Ус­та­нов­ле­ние пер­вич­ной струк­ту­ры ДНК слож­нее ус­та­нов­ле­ния пер­вич­ной струк­ту­ры бел­ка. Это свя­за­но с од­но­об­ра­зи­ем её строе­ния. В 1977 го­ду бы­ла оп­ре­де­ле­на пол­ная нук­лео­тид­ная по­сле­до­ва­тель­ность ДНК бак­те­рио­фа­га YC 174 (пси-икс 174). Это вы­даю­щее­ся дос­ти­же­ние оз­на­ме­но­ва­ло со­бой на­ча­ло но­вой эры в био­хи­мии ге­нов и хро­мо­сом. С тех пор бы­ла рас­шиф­ро­ва­на нук­лео­тид­ная по­сле­до­ва­тель­ность це­ло­го ря­да ге­нов. В на­стоя­щее вре­мя в прин­ци­пе мож­но оп­ре­де­лить по­сле­до­ва­тель­ность нук­лео­ти­дов лю­бой ДНК.

Ре­шаю­щий ус­пех в ус­та­нов­ле­нии пер­вич­ной струк­ту­ры ДНК был дос­тиг­нут бла­го­да­ря 3-м ос­нов­ным дос­ти­же­ни­ям.

Пер­вым из них яви­лось от­кры­тие ре­ст­рик­ти­рую­щих эн­до­нук­ле­аз, ко­то­рые рас­ще­п­ля­ют мо­ле­ку­лы ДНК толь­ко в срав­ни­тель­но не­боль­шом чис­ле спе­ци­фи­че­ских то­чек. Это по­зво­ли­ло рас­ще­п­лять мо­ле­ку­лу ДНК на оп­ре­де­лён­ные фраг­мен­ты раз­ны­ми спо­со­ба­ми с об­ра­зо­ва­ни­ем пе­ре­кры­ваю­щих­ся по­сле­до­ва­тель­но­стей.

Вто­рым важ­ным дос­ти­же­ни­ем ока­за­лось усо­вер­шен­ст­во­ва­ние элек­тро­фо­ре­ти­че­ских ме­то­дов раз­де­ле­ния фраг­мен­тов ДНК в со­от­вет­ст­вии с чис­лом со­дер­жа­щих­ся в них нук­лео­тид­ных ос­тат­ков (с об­щим чис­лом при­бли­зи­тель­но 200 нук­лео­ти­дов, раз­ли­чаю­щих­ся все­го на один ос­та­ток).

Треть­им дос­ти­же­ни­ем ста­ла раз­ра­бот­ка ме­то­дов кло­ни­ро­ва­ния ДНК, ко­то­рое сде­ла­ло воз­мож­ным по­лу­че­ние дос­та­точ­но боль­шо­го ко­ли­че­ст­ва чис­тых мо­дель­ных ге­нов – ис­ход­но­го ма­те­риа­ла для оп­ре­де­ле­ния пер­вич­ной струк­ту­ры ДНК.

На ос­но­ва­нии все­го это­го бы­ло пред­ло­же­но 2 прин­ци­пи­аль­ных под­хо­да к оп­ре­де­ле­нию пер­вич­ной струк­ту­ры нук­леи­но­вых ки­слот – ме­тод об­ры­ва це­пи Ф. Сен­ге­ра и Р. Ко­ул­со­на и ме­тод хи­ми­че­ско­го рас­ще­п­ле­ния (А. Мак­са­ма и В. Гиль­бер­та).

Ме­тод об­ры­ва це­пи ос­но­ван на по­лу­че­нии пол­но­го на­бо­ра убы­ваю­щих по чис­лу нук­лео­тид­ных ос­тат­ков ко­пий од­но­це­по­чеч­ной ДНК с по­мо­щью ДНК-по­ли­ме­раз­ной ре­ак­ции. При этом ис­поль­зу­ют­ся 4 ре­ак­ци­он­ные сме­си, в ка­ж­дую из ко­то­рых до­бав­ля­ют, по­ми­мо 4-х мо­но­ме­ров, ана­лог од­но­го из ос­но­ва­ний (2¢,3¢-ди­де­зок­сиа­на­лог) в ка­че­ст­ве тер­ми­на­то­ра рос­та це­пи. За­тем це­пи в ка­ж­дой сме­си раз­де­ля­ют с по­мо­щью гель-элек­тро­фо­ре­за и про­во­дят ра­дио­ав­то­гра­фию с по­мо­щью ра­дио­ак­тив­но­го фос­фо­ра (Р-32). По чис­лу на­блю­дае­мых по­лос ус­та­нав­ли­ва­ют чис­ло нук­лео­тид­ных ос­тат­ков ДНК или её фраг­мен­та и вы­яв­ля­ют по­ло­же­ние азо­ти­стых ос­но­ва­ний с по­мо­щью осо­бых ре­ак­ций на 3¢-кон­це ка­ж­до­го из фраг­мен­тов.

Ме­тод хи­ми­че­ско­го рас­ще­п­ле­ния. В со­от­вет­ст­вии с этим ме­то­дом про­во­дят хи­ми­че­скую мо­ди­фи­ка­цию азо­ти­стых ос­но­ва­ний в ДНК (ре­ак­ция­ми ал­ки­ли­ро­ва­ния, аци­ли­ро­ва­ния). За­тем из­би­ра­тель­но рас­ще­п­ля­ют це­поч­ку ДНК по мес­ту мо­ди­фи­ци­ро­ван­ных ос­но­ва­ний, про­во­дят раз­де­ле­ние про­дук­тов рас­ще­п­ле­ния в по­ли­ак­ри­ла­мид­ном ге­ле с по­мо­щью элек­тро­фо­ре­за. По­сле это­го ана­ли­зи­ру­ют по­лу­чен­ные элек­тро­фо­ре­грам­мы и по по­ло­же­нию мо­ди­фи­ци­ро­ван­но­го азо­ти­сто­го ос­но­ва­ния вос­ста­нав­ли­ва­ют пер­вич­ную струк­ту­ру в ана­ли­зи­руе­мом фраг­мен­те ДНК.

Не­дав­но с ис­поль­зо­ва­ни­ем по­след­них вер­сий опи­сан­ных ме­то­дов бы­ла ус­та­нов­ле­на пол­ная пер­вич­ная струк­ту­ра ге­но­ма че­ло­ве­ка.