Титрование вирусов животных по методу «бляшек по Дульбекко»

Титр вируса можно определить:

·методом предельных (конечных) разведений;

·в реакции гемагглютинации;

·методом бляшек.

Метод бляшек позволяет определить титр вируса путем подсчета локальных повреждений (бляшек), которые вызывает вирус в культуре ткани. Титр вируса, выраженный как число бляшкообразующих единиц в 1 мл, отражает количество вирусных частиц в 1 мл препарата, способных вызвать инфекционный процесс в условиях эксперимента. Бляшкообра­зование зависит от множества факторов: качества агара, сыворотки, чис­тоты стекла и др.

Титрование вируса методом бляшек:

1. Для получения монослоя за день до постановки экспери­мента высевают примерно по 2·10⁶ клеток HeLa на чашки Петри диаметром 50 мм.

2. Готовят последовательные логарифмические разведения вируса на бессывороточной среде. Аликвоты каждого разведе­ния вносят в три чашки, предварительно удалив из них куль­туральную среду.

3. Клетки инкубируют с вирусом около 90 мин при 37⁰ С.

После окончания инкубации супернатант удаляют и монослой заливают средой с агаром, приготовленной по следующей про­писи (МОЖНО СКАЗАТЬ ПРОСТО СПЕЦИАЛЬНОЙ СРЕДЫ):

На 100 мл среды:

20 мл 2,5% -ного водного раствора агара Нобль 20 мл пятикратной среды (без глутамина)

10 мл триптозофосфатного бульона (2,95 г на 100 мл) 9 мл бикарбоната натрия (2,25 г на 100 мл)

2 мл СНТ

2 мл 1 М MgC1₂

По 1100 ед. пенициллина и стрептомицина 2 мл глутамина (2,9 г на 100 мл)

Воды до 100 мл

Расплавляют агар, а затем охлаждают его до 50 ^ОС. Осталь­ные компоненты среды перемешивают друг с другом, подогревают до 42 ^ОС и добавляют к агару, устанавливая температуру 45 ^ОС. В каждую чашку наливают по 5 мл приготовленной сре­ды и охлаждают до затвердения агара. Чашки инкубируют при 37⁰С в течение 4 дней в атмосфере 5%-ного СО₂.

4. Через 4 дня добавляют еще 5 мл среды с агаром и про­должают инкубацию еще в течение 4-5 дней. Как правило, бляшки формируются к концу этого срока. Они становятся ви­димыми после фиксации и окрашивания. Для титрования аденовирусов методом бляшек клеточный монослой дол­жен оставаться интактным на протяжении 8-10 дней культи­вирования; поэтому в данном случае особое значение имеет со­стояние используемых клеток. Например, клетки, зараженные микоплазмой, не образуют стабильного монослоя и поэтому не пригодны для данного метода. Точность подсчета зависит от количества бляшек; идеальные результаты получают, если на каждой чашке Петри сформировалось 20-50 бляшек.

5. Клетки фиксируют 10 мин раствором формалина (4%-ный формалин в 0,15 М NaCI), а затем окрашивают 5 мин кристал­лическим фиолетовым (0,1 % в 2%-ном водном этаноле).