Количественный метод учета вирусов

Подсчёт количества вирусных частиц осуществляется наиболее часто с использованием электронного микроскопа. Когда готовятся препараты, представляющие собой смесь полистерольных шариков известных концентраций, смешиваются с вирусным материалом (суспензии) полученной при заражении животных, растений. В случае бактерий просто: там подсчитываются бляшки и на основании количества бляшек делается заключение о количестве активных бактериофаговых частиц. Так вот смесь полистерольных шариков с вирусами используется для приготовления препаратов для электронной микроскопии, на специальных сеточках, подложках наносится плёнка и анализируется в электронный микроскоп. Подсчитывается в поле зрения микроскопа количество полистерольных шариков и количество обнаруженных вирусных частиц. И зная концентрацию шариков и сопоставляя с обнаруженными количествами вирусных частиц, можно говорить, что в таком-то определённом объёме данной суспензии вирусов содержится такое-то количество вирусных частиц. Естественно этот метод не совсем точный, но удобный и широко используется для количественных оценок тех или иных вирусов.

Кроме того количество вирусов характеризуется по инфекционной дозе. Наименьшее количетсво вирусной суспензии которая может вызвать заражение животных, растений с явными проявлениями клинической картины заражения. Определение размеров вирусов аналогично с подсчётом. Используются тоже полистерольные шарики известных размеров и известного диаметра. Они смешиваются и при электронной микроскопии сравниваются размеры. Делается снимок, то зная диаметр этих шариков можно вычислит размер выявляемых вирусных частиц. Кроме этого могут использоваться милипористые фильтры, нитроцеллюлозные с известным диаметром пор, через которые могут проходить вирусы с определённым размером. Этот метод менее чёткий. Можно определять размеры на основании константы седементации.

Титр б/фага. Титр бактериофага - это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бак­териофага наиболее широко в работе с бактериофагами применяется метод а гаровых слоев, предложенный А. Грациа (A. Gratia) в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получае­мых результатов и с успехом используется также для выделения бак­териофагов.

Сущность метода состоит в том, что суспензию бактериофага сме­шивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее под­готовленного 1,5%-го питательного агара в чашке Петри. В качестве верхнего слоя в классическом методе Грациа использовался водный («голодный») 0,6%-й агар. В настоящее время для этих целей чаще всего применяют 0,7%-й питательный агар. При инкубации в течение 6-18 ч бактерии размножаются внутри верхнего «мягкого» слоя агара в виде множества колоний, получая питание из нижнего слоя 1,5%-го питатель­ного агара, который применяется в качестве подложки. Низкая концен­трация агара в верхнем слое создает пониженную вязкость, что способ­ствует хорошей диффузии фаговых частиц и инфицированию ими бакте­риальных клеток. Инфицированные бактерии подвергаются лизису, в ре­зультате чего появляется потомство фага, которое вновь заражает нахо­дящиеся в непосредственной близости с ними бактерии. Образование не­гативной колонии для фагов Т-группы вызвано только одной частицей бактериофага, и, следовательно, число негативных колоний служит ко­личественным показателем содержания бляшкообразующих единиц в исследуемом образце.

Культура чувствительных к фагу бактерий используется в логариф­мической фазе роста в минимальном количестве, обеспечивающем полу­чение сплошного газона бактерий. Соотношение числа фаговых частиц и бактериальных клеток (множественность инфекции) для каждой систе­мы «фаг - бактерия» подбирается экспериментально с таким расчетом, чтобы на одной чашке образовывалось 50-100 негативных колоний. ₍₇я/ Для титрования бактериофага может быть использован также од­нослойный метод, состоящий в том, что на поверхность чашки с пита­тельным агаром вносят суспензии бактерий и бактериофага, после чего смесь распределяют стеклянным шпателем. Однако этот метод уступает в точности методу агаровых слоев и поэтому не нашел широкого при­менения.

Техника титрования и культивирования бактериофагов. Для опре­деления титра бактериофага последовательно разводят исходную фаго­вую суспензию в буферном растворе либо в бульоне (шаг разведения -Ю^-1). Для каждого разведения используют отдельную пипетку, а смесь интенсивно перемешивают. Из каждого разведения суспензии делают «высев» фага на газон чувствительных бактерий Е. coli В (рис. 3). Для этого 1 мл разведенного фага вносят в пробирку с 3 мл расплавленного и охлажденного до 48-50 °С «мягкого агара», после чего в каждую про­бирку добавляют 0,1 jw культуры^ чувствительного микроорганизма (Е. coli В), находящегося в логарифмической фазе роста. Содержимое перемешивают, вращая пробирку между ладонями и избегая образования пузырей. Затем быстро выливают на поверхность агаризованной (1,5%-й) питательной среды в чашке Петри и равномерно распределяют по ней, осторожно покачивая чашку. При титровании методом агаровых слоев следует засевать параллельно не менее двух чашек одного и того же раз­ведения фага. После застывания верхнего слоя чашки переворачивают крышками вниз и помещают в термостат с температурой 37 °С, опти­мальной для развития чувствительных бактерий. Учет результатов про­изводят через 18-20 ч инкубирования.

Количество негативных колоний подсчитывают аналогично подсче­ту колоний бактерий, а титр фага определяют по формуле:

N=

где N - количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материала; к -среднее количество негативных колоний на чашку; D - номер разведе­ния; V — объем высеваемой пробы, мл.

В том случае, когда необходимо определить множественность ин­фекции, параллельно проводят определение титра жизнеспособных кле­ток бактерий Е. coli В в 1 мл питательного бульона. Для этого делают разведение исходной суспензии бактериальных клеток до КГ⁶ и высева­ют ее (0,1 мл) параллельно на 2 чашки. После инкубирования при темпе­ратуре 37 °С в течение 24 ч подсчитывают количество образовавшихся колоний на чашке Петри и определяют титр клеток.