Экспериментальные доказательства инфекциозности НК вирусов

1935 г. – Стенли получил ВТМ в кристаллическом виде.

Что касается функции нуклеиновых кислот, то тут все видимо просто. Вирусные нуклеиновые кислоты являются генетическим материалом, хранящем всю информацию о данном вирусе и обеспечивающим реализацию данной информации в процессе вегетативного цикла репродукции вируса.

Изучение нуклеиновых кислот вирусов позволило в первую очередь показать, что рибонуклеиновая кислота тоже выполняет генетические функции. Это на примере ВТМ, нуклеиновый компонент которого представлен рибонуклеиновой кислотой и эта рибонуклеиновая кислота, как было показано, является инфекциозной и при введении в клетки растений вызывает развитие инфекции и формирование вирусных частиц, с полноценным белком соответствующим данному вирусу, из которого выделена РНК. Этим было доказано, что не только ДНК является веществом наследственности, но и РНК у вирусов. РНК была обнаружена в составе некоторых бактериальных вирусов. В частности при открытии фага f2.

1936-37г. – Боуден и Пири установили, что частица ВТМ в действительности является не «чистым» белком, а содержит также около 5% РНК от общей массы вируса.

1944г. – Шрамм проводил диссоциацию вирусных частиц на НК и белок используя слабо-щелочной гидролиз. Получал фракции РНК и белка.

1955 г. – Ф. Конрат модифицировал эксперимент. Сдвигал рН, вирусные частицы распадались на 2 фракции: РНК и белок. Этими фракциями обрабатывал растения, но ничего не получалось (болезнь не развивалась) т.к. НК не могла проникнуть внутрь клетки. Лишь спустя год в 0,1% случаев развивалось заболевание.

1956-57г. – Х.Френкель-Конрат и Р.Уильямс произвели реконструкцию ВТМ и доказали, что именно РНК ответственна за развитие заболевания.

ДНК: Ну и наконец известный вам эксперимент синтеза биологически активной фаговой нуклеиновой кислоты фага φx174, эксперимент Гоулеана, Корнберга и Синсхаймера. Выделялась нуклеиновая кислота фага φx174, меченая по тритию, вводилась в систему Корнберга, содержащую ДНК-полимеразу, затравку, ДНК-лигазу, 4 нуклеотида, тимидиловый был заменен на бромурацильный (бромурацил меченый по фосфору). В этой системе синтезировалась репликативная форма двунитевая молекула, состоящая из исходной кольцевой молекулы плюс-нити и вновь синтезированной минус-нити. ДНК-лигаза добавлялась, чтобы бреши склеить. Затем добавлялась ДНК-аза, которая резала одну из нитей. Затем репликативная форма подвергалась тепловой денатурации. При этом возникали кольцевые минус-нити, искусственно синтезированные, тяжелые и радиоактивные, цельные плюс-нити, тоже радиоактивные и однонитевые молекулы. Это подвергалось центрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия, выделялись тяжелые кольцевые молекулы ДНК, минус-нити синтезированные на первом этапе. Эти минус-нити вводились в систему Корнберга, где уже 5-бромурацил не добавлялся, получалась также репликативная форма двунитевая. ДНК-аза резала одну из нитей, получалась смесь, но выделялись не тяжелые молекулы, а легкие синтезированные на искусственно полученной ранее матрице. Эти легкие плюс-нити использовались для заражения сферопластов кишечной палочки. В таких инфицированных сферопластах репродуцировался полноценный фаг φx174. Конечно, эффективность заражения была довольно низкой. Но дело не в том, сколько там получилось фага, а в том, что фаг получился. В дальнейшем Карана синтезировал полный геном без всяких ухищрений подобного рода, фага φx174