Синтез биологически активной ДНК фага φx174 «in vitro»

Эксперимент синтеза биологически активной фаговой нуклеиновой кислоты фага φx174, эксперимент Гоулеана, Корнберга и Синсхаймера 1961г. (рис.9.10, л3). Выделялась нуклеиновая кислота фага φx174, меченая по тритию, вводилась в систему Корнберга, содержащую ДНК-полимеразу, затравку, ДНК-лигазу, 4 нуклеотида, тимидиловый был заменен на бромурацильный (бромурацил меченый по фосфору). В этой системе синтезировалась репликативная форма двунитевая молекула, состоящая из исходной кольцевой молекулы плюс-нити и вновь синтезированной минус-нити. ДНК-лигаза добавлялась, чтобы бреши склеить. Затем добавлялась ДНК-аза, которая резала одну из нитей. Затем репликативная форма подвергалась тепловой денатурации. При этом возникали кольцевые минус-нити, искусственно синтезированные, тяжелые и радиоактивные, цельные плюс-нити, тоже радиоактивные и однонитевые молекулы. Это подвергалось центрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия, выделялись тяжелые кольцевые молекулы ДНК, минус-нити синтезированные на первом этапе. Эти минус-нити вводились в систему Корнберга, где уже 5-бромурацил не добавлялся, получалась также репликативная форма двунитевая. ДНКаза резала одну из нитей, получалась смесь, но выделялись не тяжелые молекулы, а легкие, синтезированные на искусственно полученной ранее матрице. Эти легкие плюс-нити использовались для заражения сферопластов кишечной палочки. В таких инфицированных сферопластах репродуцировался полноценный фаг φx174. Конечно, эффективность заражения была довольно низкой. Но дело не в том, сколько там получилось фага, а в том, что фаг получился. В дальнейшем Карана синтезировал полный геном без всяких ухищрений подобного рода, фага φx174.