![]() |
Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | |
|
Принцип метода: Определение молочной кислоты основано на реакции катализируемой ЛДГ (см. выше) и тесте-Варбурга – спектрофотометрической регистрации прироста НАДН при длине волны 340 нм, эквимолярному окисленной молочной кислоте.
Ход работы:
1.Этап. Получение безбелкового экстракта молочной кислоты.
В центрифужную пробирку отмерить 0,5 мл. крови (сыворотки) и 1 мл 0,6 М хлорной кислоты. Через 5 мин. инкубации осадить белки центрифугированием при 5 тыс.об/мин., в течение 5 минут. Полученную надосадочную жидкость слить в чистую пробирку и использовать для исследования в следующем этапе.
2.Этап. Запуск реакции и инкубирование.
Приготовить реакционную смесь (табл. 4)
Таблица 4. Приготовление реакционной смеси
Реагенты (мл). | Пробирки | |
Опыт | Контроль | |
Буферный раствор | 2,0 | 2,0 |
Хлорный экстракт | 0,2 | - |
Р – р. НАД | 0,1 | 0,1 |
Р – р. хлорной кислоты | - | 0,2 |
Инкубирование провести в термостате при 39 градусах, в течение 30 минут.
3.Этап. Спектрофотометрирование.
Содержимое пробирок опыта и контроля поочередно перелить в чистые кюветы и снять показания экстинций с прибора при длине волны 340 нм., против воздуха.
4.Этап. Расчет: Еоп – Ек = DЕ
С ммоль/л = DЕ х 10535, где 10535 – коэффициент пересчета в ммоль/л.
В нормальной венозной сыворотке крови содержание молочной кислоты находится в пределах – 0,6 – 1,6 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение: Определение активности ЛДГ и содержания молочной кислоты в сыворотке крови широко используется в клинической практике для характеристики функционального состояния гликолиза, тканевого дыхания и проницаемости клеточных мембран. Так при снижении или полном прекращении поступления кислорода в ткани, при ингибировании или структурном повреждении ферментов тканевого дыхания происходит повышение обоих биохимических показателей. Однако при большинстве патологических состояний повышенная активность гликолиза и проницаемость мембран сочетаются и это приводит к более резкому увеличению концентрации МК и активности ЛДГ, например, при воспалительных процессах в почках, мышцах, ишемии тканей и т.д.
Существуют патологические состояния, когда наоборот, активность гликолиза снижается - при гипогликемических состояниях, дефиците регуляторных факторов, стимулирующих гликолиз или при его ингибировании.
Дата публикования: 2014-11-02; Прочитано: 1432 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!