Методи визначення N-кінцевих амінокислот

Реакція з динітрофторбензолом (реакція Сенгера). Динітрофторбензол реагує з аміногрупою амінокислоти і, звільняючи фтористоводневу кислоту, утворює динітрофеніламінокислоту (ДНФ-ак):

Ця реакція може відбуватися і за участю амінокислот, що входять в білок, але тільки по їх вільних аміногрупах. Якщо після завершення реакції провести гідроліз білка, то всі амінокислоти вивільняються. Гідроліз не порушує структуру ДНФ-ак. Використовуючи розчинність ДНФ-ак в органічних розчинниках, можна відділити, а отже і ідентифікувати амінокислоти, які, знаходячись у складі білка, мали вільні аміногрупи.

Реакція з 1-диметиламінонафтил-5-сульфонілхлоридом (дансилом, ДНС-метод). Більш чутливим, ніж динітрофенільний, є дансильний метод визначення N-кінцевих амінокислот. Суть цього методу полягає в тому, що N-кінцева амінокислота пептиду в лужному середовищі взаємодіє з 1-диметиламінонафтил-5-сульфонілхлоридом (дансилом). При цьому утворюється диметилнафтилсульфоніл-білок (ДНС-білок):

Далі здійснюють кислотний гідроліз ДНС білка 20% розчином HCl, що призводить до утворення вільних амінокислот і N-кінцевої амінокислоти у вигляді ДНС-похідного:

Після цього ДНС-амінокислоту, завдяки інтенсивній флуоресценції дансильних груп, виявляють і кількісно визначають.

Реакція з фенілізотіоціанатом (реакція Едмана). Фенілізотіоціанат в слаболужному середовищі реагує з аміногрупою:

У слабокислому середовищі продукт цієї реакції циклізується. Якщо піддати амінокислоту, яка входить до складу білка, дії фенілізотіоціаната, то її можна виділити й ідентифікувати у формі фенілтіогідантоїнового (ФТГ-ак) похідного:

Цей метод дозволяє ідентифікувати кінцеві амінокислоти білка, аміногрупи яких вільні. Утворення ФТГ-ак не вимагає гідролізу решти частини білка.

Для визначення N-кінцевих залишків амінокислот крім хімічних методів використовують також і ферментативні. З цією метою використовують фермент з групи екзопептидаз – лейцинамінопептидазу, яка діє на пептид з N-кінця.

Кольорові реакції. Нінгідрин здійснює декарбоксилування a-амінокислот з утворенням СО₂, NH₃ і альдегіду, який містить на один атом вуглецю менше, ніж вихідна амінокислота. Відновлений нінгідрин реагує з вільним аміаком, утворюючи блакитний комплекс з максимумом поглинання при l_max=570 нм:

Утворення цієї забарвленої сполуки використовується в кількісному тесті на a-амінокислоти, за допомогою якого є можливість виявити їх, якщо навіть вони знаходяться у концентрації до 1мкг. Нінгідрин реагує не тільки з амінокислотами, але і з другими амінами; при цьому також утворюється блакитне забарвлення, але не виділяється вуглекислий газ. Таким чином, саме виділення СО₂ є індикатором участі в реакції a-амінокислоти. Аміак і пептиди також вступають в реакцію з нінгідрином, але менш активно ніж a-амінокислоти. Продукт реакції між проліном (гідроксипроліном) і нінгідрином має жовте забарвлення.

Флуорескамін є ще більш чутливим реагентом, який дозволяє виявляти амінокислоти в кількості порядку нанограм. Як і нінгідрин, він утворює комплекс не тільки з амінокислотами, але і іншими амінами.

Утворення пептидних зв’язків. Найбільш важливою реакцією, в якій приймають участь амінокислоти, є утворення пептидних зв’язків. При цьому виділяється одна молекула води:

Однак, реакція здійснюється не так, як показано на малюнку, оскільки рівновага сильно зміщення в сторону гідролізу пептичного зв’язку. Для утворення пептидного зв’язку між двома амінокислотами карбоксильна група повинна бути попередньо активована. Хімічний синтез здійснюється шляхом попереднього утворення хлорангідриду. Біологічна активація включає взаємодію з АТФ.

Властивості індивідуальних амінокислот. Гліцин, найменша з амінокислот, може локалізуватися в таких областях трьохвимірної структури, які недоступні для інших.

Аліфатичні R–групи аланіну, валіну, лейцину і ізолейцину, а також ароматичні R-групи фенілаланіну, тирозину і триптофану – гідрофобні; ця властивість призводить до одного важливого наслідку – утворення впорядкованого поверхневого шару молекул води в області поверхні молекули білка, де експоновані неполярні R–групи. Заряджені R–групи основних і кислих амінокислот відіграють важливу роль в стабілізації специфічної конформації білка шляхом утворення сольових зв’язків. Крім того, амінокислоти з позитивно і негативно зарядженими R–групами, а також гістидин можуть приймати участь у формуванні систем “перенесення заряду”, які в ході ферментативного каталізу забезпечують переміщення заряду на значні відстані. І на завершення, унікальна і важлива роль у ферментативному каталізі належить гістидину – рК імідазольної групи при рН=7 може позмінно виступати в ролі основного або кислотного каталізатора.

Первинна спиртова група серину і первинна тіоспиртова група (–SH) цистеїну є добрими нуклеофілами які приймають участь в ферментативному каталізі. Хоча вторинна спиртова група треоніну теж виявляє нуклеофільні властивості, але дані про її можливу каталітичну функцію відсутні. Окрім каталітичної функції –ОН група серину приймає участь в регуляції активності деяких ключових ферментів метаболізму, активність яких залежить від фосфорилювання окремих залишків серину.

Амінокислоти не поглинають світло в видимій частині спектру (іншими словами, вони не мають забарвлення). За виключенням ароматичних кислот і гістидину, вони не поглинають світло і в ультрафіолетовій області при довжинах хвиль вище 240 нм.

Методи виділення та ідентифікації амінокислот. Фракціонування і визначення окремих амінокислот. Деякі амінокислоти дають кольорові реакції або володіють характерним спектром поглинання, що створює можливість їх кількісного визначення. Існують, проте, і більш загальні методи, що дозволяють ідентифікувати, а потім і визначити вміст кожної з амінокислот в суміші після фракціонування. Ці методи можуть бути використані при дослідженні тканинних екстрактів, біологічних рідин (плазми крові, сечі) або білкових гідролізатів, в яких зв'язок між амінокислотами вже розірваний.

Хроматографія на папері (Мартін, Гордон і Синдж). Цей метод відіграє важливу роль при аналізі амінокислот, і сама техніка хроматографії на папері була розроблена саме для цієї мети.

Коли мають справу з складною сумішшю амінокислот, наприклад при аналізі гідролізата білків, доводиться вдаватися до двомірної хроматографії. При проведені хроматографії в одному напрямі часто використовують як розчинник фенол, а в перпендикулярному – суміш бутанола і водного розчину оцтової кислоти. Амінокислоти проявляють за допомогою нінгідрина при підвищеній температурі. Амінокислоти, які відносяться до однієї групи, розташовуються на одній плавній кривій.

Іонообмінна хроматографія на колонці (Мур і Стейн). Цей метод дозволяє проводити кількісне визначення амінокислот у суміші. Скляну колонку заповнюють смолою, яка містить на матриці полістиролу угрупування – SO₃H^-Na⁺. В кислому середовищі амінокислоти поводять себе як основи. Вони утворюють катіони, здатні витісняти частину іонів Na⁺ і, займаючи їх місце, затримуватися на колонці. Чим більш основною є дана амінокислота, тим міцніше вона зв'язується електростатичними силами із смолою. Потім через колонку пропускають елюючу рідину, поступово збільшуючи її рН (градієнт рН). Коли рН елюента наближається до значення рН, відповідного даній амінокислоті, вона відділяється від смоли і починає рухатися уздовж колонки. Оскільки величини pHi для різних амінокислот неоднакові, амінокислоти виходять з колонки по черзі. Необхідно, проте, мати на увазі, що міцність зв'язку між амінокислотою і смолою обумовлена не тільки електростатичними силами, а залежить також від сил іншої природи. Тому в деяких випадках порядок виходу амінокислот може не відповідати порядку зміни величини рНi. Процес проведення хроматографії залежить від температури. Методика колоночної хроматографії використовується в двох варіантах:

а) в поєднанні з колектором фракцій. Амінокислоти збирають в окремі пробірки у вигляді невеликих фракцій. В кожну з пробірок додають нінгідрин і нагрівають (реакцію з нінгідрином проводять зазвичай при підвищеній температурі). За допомогою спектрофотометра вимірюють потім спектри поглинання кожної з фракцій і, виходячи з отриманих даних, обчислюють концентрацію кожної амінокислоти. Таким чином одержують серію кривих, що відповідають послідовному виходу амінокислот. Природу кожної амінокислоти встановлюють за об'ємом елюента, що витрачається на зняття цієї амінокислоти із смоли, з урахуванням заздалегідь проведених калібрувальних дослідів;

б) з автоматичним аналізатором, що працює за таким принципом. Рідина, що витікає з колонки, за допомогою насоса змішується з нінгідрином. Суміш проходить спочатку через водяну баню, де підігрівається, а потім через кювету спектрофотометра, який безперервно реєструє поглинання світла при 570 нм (фіолетове забарвлення нінгідрииа зі всіма амінокислотами) і при 440 нм (жовте забарвлення проліна з нінгідрином). Дані спектрофотометра реєструються на стрічці, що рухається, або на листі паперу. Площа, яка обмежена кривою і базовою лінією, пропорційна концентрації відповідної амінокислоти.

Електрофорез. Завдяки своєму електричному заряду амінокислоти можуть переміщуватися в електричному полі (рис. 1). Проте через малий розмір молекул вони легко дифундують і тому їх розділення можливе тільки при використанні твердої основи, наприклад паперу або крохмалю. Розділення йде по групах. Так, наприклад, при рН 4,0 дикарбонові амінокислоти ще залишаються кислотами і аніонами. Вони прямують до позитивного полюса – аноду. Нейтральні ж і лужні амінокислоти рухаються в цих умовах до негативного полюса – катоду, оскільки при рН 4,0 вони несуть позитивний заряд.

Рис. 1. Прилад для проведення електрофорезу (а), електрофореграма (b).