Фізико-хімічні властивості білків

Розчинність. Більшість білків розчинна у воді і у водних розчинах. Розчинність залежить від будови молекул білка і іонного складу середовища, зокрема від іонної сили і рН.

Іонна сила (m) розчину іонізованої солі визначається як половина суми концентрації кожного іона, помножена на квадрат його валентності (тобто заряду):

де с – концентрація кожного з іонів; Z – електричний заряд іона (електровалентність).

При низькій іонній силі іони, особливо однозарядні, сприяють розчиненню білка, нейтралізуючи його заряджені групи. Так, деякі білки нерозчинні у воді, але розчиняються в розбавлених розчинах NaCl. При високій іонній силі має місце зворотна дія іонів – вони сприяють осадженню білків. Все відбувається так, ніби то між білками і іонами має місце конкуренція за молекули води. Це феномен висолювання. Залежність розчинності білків від іонної сили описується рівнянням:

де S – розчинність білка; m – іонна сила середовища; b – константа, залежна від природи білка і середовища; К' – константа висолювання.

У напівлогарифмічному масштабі крива висолювання є прямою лінією, характерною для кожного даного білка.

Залежність розчинності від рН виражається, як правило, U-подібною кривою з мінімумом поблизу ізоелектричної точки. При рНi сили відштовхування між молекулами білка стають мінімальними і виникає тенденція до утворення агрегатів, які випадають в осад.

Органічні розчинники, у тому числі етанол і ацетон, осаджують білки в результаті їх денатурації. Її можна, проте, уникнути, працюючи при низькій температурі.

Денатурація білків. Вторинна і третинна структури білка обумовлені наявністю слабких зв’язків. У випадку розриву їх ці структури зникають. Такий білок називають денатурованим, його молекула стає невпорядкованою і набуває характеру „статичного клубка”. Якщо денатуруючий агент діє не дуже сильно, молекула може втратити свою структуру не повністю. Як правило, денатурація носить необоротний характер, але в деяких випадках вона буває оборотною, тобто при видаленні денатуруючих агентів білок може „ренатурувати”. Денатурація часто супроводжується осадженням білка, його молекули набувають здатності до утворення агрегантів, не здатних розчинятися в розчині. У більшості випадків у результаті денатурації білки втрачають свої біологічні властивості, наприклад ферментативну активність.

Найважливішими денатуруючими агентами є:

– підвищення температури, при якій розриваються водневі та гідрофобні зв’язки;

– кислоти і основи, надаючи підвищені заряди, дестабілізують загальну структуру, діючи особливо на електростатичні зв’язки;

– органічні розчинники суттєвим чином впливають на гідрофобні зв’язки. Але при зниженій температурі можуть не проявляти денатуруючого ефекту;

– сечовина і гуанідин утворюють з білком численні водневі зв’язки і тим самим дезорганізовують його структуру. Однак часто при видаленні цих факторів спостерігається ренатурація білкової молекули.

Денатурація ніколи не порушує ковалентних зв’язків, але вона може зробити доступними для розчинників і різних реактивів радикали, які раніше були сховані в глибині молекули.

Отже, білки у воді можуть утворювати колоїдні розчини за рахунок зарядів (обумовлених зарядженими амінокислотними залишками) та зв'язування води залишками полярних гідрофільних амінокислот. Осадження білків проводять віднімаючи воду та нейтралізуючи заряд (етанол, формальдегід, солі важких металів, розчини кислот, лугів, солей, трихлороцтової та сульфосаліцилової кислот, нагріванням). Солі типу сульфату амонію розривають іонні зв'язки, які легко відновлюються, спирт та ацетон віднімають воду, що призводить до осадження, але за умов видалення цих факторів білки відновлюють розчинність. Сильні фактори приводять до незворотнього осадження – денатурації, при цьому порушується просторова (третинна та вторинна) структура білків і зникають їх життєво важливі (нативні) функції. Денатуровані білки розвертають ланцюг, відкриваючи скриті групи, легко розщеплюються.

Електролітичні властивості. Білки є амфотерними електролітами. Групи NH₂ і COOH за винятком тих, які належать кінцевим амінокислотам, не вносять внеску в утворення сумарного заряду білка, оскільки вони входять до складу пептидних зв'язків і втрачають при цьому свої заряди. Заряд білка визначається дистально розташованими групами полярних амінокислот, як кислими (Глу, Acп, Тир), так і основними (Ліз, Apг, Гіс).

У залежності від амінокислотного складу білки можуть бути кислими (багато глутамінових та аспарагінових амінокислотних залишків), лужними (багато залишків лізіну, аргініну, гістидину), нерозчинними (багато залишків гідрофобних амінокислот). У лужному середовищі білок поводить себе як поліаніон, його сумарний заряд негативний, якщо білок, розчинений в лужному буфері, помістити в електричне поле, то він мігрує у напрямку до анода. Навпаки, в кислому середовищі білок поводиться як катіон, він несе позитивний заряд і в електричному полі рухається у напрямку до катода.

При деякому проміжному значенні рН сума зарядів виявляється рівною нулю; аналогічно тому, як це було прийнято для амінокислот, таке значення рН називають ізоелектричною точкою. Ізоелектрична точка білків варіює між значеннями pHi=1 (пепсин) і pHi=10 (гістон). Для більшості білків рНi лежить в більш вузьких межах – від 4 до 7.

Ця їх властивість була використана Тізеліусом, який в 1937 р. запропонував новий метод аналізу суміші білків – електрофорез.

Розчин білків в буфері, тобто при певному значенні рН, заливають в нижню частину U-подібної трубки, доливають обидва кінці трубки тим же буфером і вмонтовують в них електроди. Якщо проводити електрофорез в лужному розчині, то всі білки заряджаються негативно і починають переміщуватися у напрямку до анода. Швидкість переміщення (електрофоретична рухливість) білка залежить від його рНi і від величини сумарного заряду при даному рН буфера. Таким чином, різні білки мігрують з різною швидкістю і відділяються один від одного. Межі між білками можна спостерігати за допомогою оптичної системи, яка реєструє зміну коефіцієнта заломлення.

Метод електрофореза в рідкому середовищі виявився достатньо складним, у зв'язку з чим Тізеліус запропонував ідею твердого носія (спочатку використовувався папір). Потім були використані інші типи носіїв – гель крохмалю, поліакриламідний гель, ацетат целюлози, які у принципі дозволяють отримати краще розділення білків, ніж папір. Техніка отримала назву зонального электрофореза.

Електрофорез в поліакриламідному гелі є дуже тонким методом аналізу. В даний час він отримав надзвичайно широке розповсюдження. Завдяки можливості задавати пористість гелю швидкість міграції білка тут залежить не тільки від його заряду, але також від форми молекули і від молекулярної маси (великі білки сильніше затримуються сіткою гелю і мігрують повільніше). Таким чином, цей метод є не тільки електрофоретичним, але в рівному ступені і гель-фільтраційним.

Антигенні властивості. Білки, як, втім, і деякі інші високомолекулярні сполуки, є антигенами. Це означає, що якщо білок, виділений з тканин однієї тварини, потрапляє в кров тварин іншого виду, то в певних клітинах останнього синтезується спеціальний білок, який поступає в кров, де він вступає в контакт з введеним препаратом – антигеном, пригнічуючи його можливу токсичну дію. Цей білок, що з'являється в організмі тварини у відповідь на введення чужорідної субстанції, називається антитілом.

Реакції такого роду називають імунологічними реакціями. Вони дозволяють зрозуміти, чому певні захворювання бактерійного або вірусного походження не можуть з'явитися двічі у одного і того ж індивідуума, а також механізм вакцинації і сироваткової терапії. Вони пояснюють також і відторгнення трансплантованих тканин. Якщо змішати в певній пропорції антигени і відповідні їм антитіла, то можна спостерігати утворення осаду. Це явище (преципітація) лежить в основі самого споживаного методу виявлення білків, заснованого на взаємодії антиген – антитіло (рис. 8).

Рис. 8. Антигенні властивості білка

Імунологічні реакції давно вже дозволили показати, що білки, нібито однакові у всіх видів тварин, насправді несуть у своїй структурі міжвидові відмінності. Розшифровка первинної структури відповідних білків підтвердила існування міжвидових відмінностей. Проте, якщо до антитіл, утворених у відповідь на ін'єкцію чужорідного білка А, додати білок схожої будови А', то можна спостерігати появу осаду, хоча спорідненість антитіл до білка А' виявляється набагато слабіше, ніж до білка А. Говорять, що має місце перехресна реакція. Вона виявляється в тих випадках, коли А і А' це аналогічні білки, отримані від дуже близьких видів (людина і мавпа, споріднені бактерії).

Резюмуючи, можна сказати, що реакція антитіло – антиген in vitro між сироваткою крові і якимсь білком реалізується при виконанні наступних умов: 1) тварині, від якої була отримана сироватка, вводять той же або дуже близький білок; 2) введений білок є чужорідним для тварини.

Та частина білка, яка безпосередньо бере участь в утворенні комплексу з антитілом, називається антигенною детермінантою. Антигенні детермінанти реагують із специфічними ділянками антитіл (не менше двох однакових ділянок на молекулу), причому в основі відповідних взаємодій лежить принцип комплементарності форм двох взаємодіючих молекул. Необхідною умовою взаємодії є інтактність структур обох білків – у разі денатурації хоча б одного з них реакція антиген – антитіло не відбувається. Асоціація антигена з антитілом здійснюється за рахунок слабих, нековалентних зв'язків.