Генетическая инженерия

Генная инженерия – раздел генетики, позволяющий модифицировать генетический состав организма и конструировать организмы с новыми свойствами. Генетическая инженерия является основой биотехнологии и используют для получения:

1. Продуктов микробного синтеза: антибиотиков, ферментов, иммунодепрессантов;

2. Рекомбинантных и векторных вакцин («Энджерикс В» – генноинженерная вакцина против гепатита В);

3. Лекарственных рекомбинантных препаратов (инсулина, паратиреоидного гормона, гормона роста костей, активатора тканевого плазминогена, эритропоэтина, интерлейкинов);

4. Трансгенных животных и растений;

5. Микроорганизмов-деструкторов, разрушающих загрязнители окружающей среды;

6. Проведения генной терапии (введение нормально функционирующего гена).

В основе методов, используемых для создания генетически модифицированных организмов, лежит метод клонирования, заключающийся в: 1) выделении определенного гена из большого сложноустроенного генома; 2) переносе этого гена в маленький легко манипулируемый геном – вектор; 3) встраивании вектора в клетку-реципиента; 4) экспрессии гена в клетке-реципиенте.

Векторы - система доставки генетической информации в клетку реципиента. В состав вектора перед рекомбинантным геном вводят сильный промотор, который: 1) распознается клеткой-реципиентом; 2) имеет высокую аффинность к РНК полимеразе, благодаря чему ген быстро транслируется в мРНК. В качестве векторов используют плазмиды и бактериофаги.

Плазмидные векторы. Имеют небольшие размеры. Их метят геном антибиотикорезистентности, в который и осуществляют вставку чужеродной генетической информации. По утрате клеткой антибиотикорезистентности судят об успешности инсерции в вектор чужеродной генетической информации. Чем меньше плазмидный вектор, тем больший участок рекомбинантной ДНК может быть введен.

Векторные бактериофаги. У бактериофага l одна треть генома может быть вырезана и заменена чужеродной ДНК. In vitro добавляют клонируемую ДНК и образуется рекомбинантная молекула, которая упаковывается в фаговую частицу. Фаг инфицирует чувствительный к нему микроорганизм и вносит рекомбинантную ДНК. Позволяет клонировать большие фрагменты ДНК.

Этапы клонирования:

1. Изолируют ДНК из микроорганизма-донора и нарезают ее рестриктазами на фрагменты с липкими концами.

2. Разрезают вектор аналогичными рестриктазами, в результате чего образуются линейные молекулы с липкими концами.

3. Смешивают фрагменты клонируемой ДНК с разрезанным клонирующим вектором, в результате чего образуются рекомбинантные молекулы.

4. Проводят электропорацию (трансформация под действием высоковольтного электрического разряда) бактерии-реципиента (легко культивируемые микроорганизмы E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae).

5. Проводят скрининг трансформантов. Способность синтезировать рекомбинантный белок трансформантом определяют в серологических реакциях, либо по приобретенной клеткой ферментативной активности.

Некоторые Молекулярные Механизмы Патогенеза Инфекционных болезней: Секреторные системы микроорганизмов

В настоящее время у грамотрицательных микроорганизмов известны 5 систем секреции белков-эффекторов (белков, выполняющих определенную функцию, в т.ч. и вирулентную) во внешнюю среду – I, II, III, IV, V, которые отличаются механизмом доставки белковых молекул во внешнюю среду (рис. 10).

	I III II IV

Первый тип секреторной системы

Первая секреторная система (ПТСС) состоит из трех компонентов: белка-порина в наружной мембране, белка слияния мембран (MFP – membrane fusion protein), АТФ-связывающей кассеты в цитоплазматической мембране (АВС). Белки ПТСС секретируются во внешнюю среду через канал, насквозь пронизывающий оболочки клетки, и потому они не попадают в периплазматическое пространство и не образуют периплазматический интермедиат.

Секретируемая молекула подходит к АТФ-связывающей кассете (АВС) в цитоплазматической мембране, и в ответ на это белок слияния мембран MFP соединяет АТФ-связывающую кассету и белок-порин наружной мембраны, что приводит к образованию непрерывного канал, диссоциирующего только после прекращения секреции. Взаимодействие 3-х компонентов канала осуществляется без участия АТФ, но прохождение белка-эффектора по каналу требует затрат энергии.

Посредством этой системы E. coli секретирует a-гемолизин (Hly A), Erwinia spp. – металлопротеазу, Pasteurella haemolytica – лейкотоксин, Bordetella pertussis – аденилатциклазу.