Персонализированная медицина. Фармакогенетика. Фармакогеномика

Цель персонализированной медицины состоит в том, чтобы найти конкретное лекарство для конкретного больного, разработать схему лечения больного в соответствии с его генотипом и обосновать меры профилактики. В более широком смысле персонализированная медицина представляет собой интегральную медицину, которая включает разработку персонализированных средств лечения на основе геномики, тестирование на предрасположенность к болезням, профилактику, объединение диагностики с лечением и мониторинг лечения.

Термин «personalized medicine» впервые появился в качестве названия монографии, изданной Кеваль Джайн (Швейцария) в 1998 г. Наряду с понятием «персонализированная медицина» (personalized medicine), для обозначения индивидуализации лечения применяют и другие термины, в том числе «предсказательная медицина» (predictive medicine) и «геномная медицина» (genomic medicine). Еще до того как предметом внимания в медицине стала концепция персонализации, индивидуальный подход применялся, например, при переливании крови, трансплантации тканей и клеточной терапии. Типирование тканей на основе генетических маркеров применяется при подборе трансплантатов для конкретных реципиентов, а в некоторых способах лечения рака используются собственные опухолевые клетки пациента.

В настоящее время концепция персонализации распространяется на все фармацевтические препараты. Стало ясно, что реакция пациентов с одной и той же болезнью на одно и то же лекарство различается в зависимости от генотипа больного (генетической конституции организма), так что возможны значительные колебания в эффективности и безопасности препарата, применяемого для лечения определенного заболевания.

Индивидуализация лечения подразумевает также досимптоматическую идентификацию предрасположенности к той или иной болезни и выбор адекватных профилактических мер.

Важную часть основ персонализированной медицины составляют шесть технологий и подходов: (I) молекулярная диагностика, в особенности определение полиморфизма по единичным нуклеотидам (SNP), (II) интеграция диагностики и лечения, (III) мониторинг лечения, (IV) фармакогенетика, (V) фармакогеномика и (VI) фармакопротеомика. Первые три составляющие известны хорошо. Но существуют некоторые различия во мнениях о сути трех последних, которые можно определить следующим образом.

Фармакогенетика — это исследование влияния генетических факторов на действие лекарств; данный термин был принят в фармакологии еще в догеномную эру. Фармакогеномика — это применение геномики для разработки новых лекарств. Она включает исследование механизмов действия лекарств на клетки на основе изучения изменений экспрессии генов. Фармакопротеомика — это применение протеомики к разработке новых лекарств, её можно рассматривать как расширение фармакогеномики.

Концептуальную основу предиктивной медицины составляют представления о генетическом полиморфизме.

Генетический полиморфизм и гены предрасположенности. В отличие от мутаций, приводящих к патологическим изменениям и снижаю­щих жизнеспособность, генетические полиморфизмы проявляются в фенотипе менее очевидно. Вместе с тем генетические полиморфизмы далеко не всегда явля­ются нейтральными, значительно чаще они приводят к появлению белковых про­дуктов с несколько измененными физико-химическими свойствами и, соответст­венно, параметрами функциональной активности. Известно, что однонуклеотидные замены (SNP) в смысловых частях гена часто влияют на такие характеристики как изменение третичной структуры белка, стабильность его связывания с суб­стратом и промежуточными метаболитами, посттрансляционную модификацию, температурный оптимум активности и пр. Неко­торые миссенс - мутации оказывают сильное влияние на гидрофобность белка, его водородные, электростатические и сульфгидрильные связи. При этом функциональный спектр таких белков может сильно меняться от практически нейтрального эффекта генетического полиморфизма до полного нарушения функции соответствующего белкового продукта.

В определенных условиях некото­рые генетические полиморфизмы могут предрасполагать либо, наоборот, пре­пятствовать проявлению различных заболеваний. Г ены предрасположенности — это мутантные гены (аллели), которые совмес­тимы с рождением и жизнью в постнатальном периоде, но при определенных неблаго­приятных условиях способствуют развитию того или иного заболевания.

В зависимости от особенностей действия и роли в метаболических процессах гены «предрасположенности» условно подразделяют на гены «внешней среды», гены - «триггеры» и гены клеточных рецепторов. Именно аллельные варианты этих генов составляют основу таких частых заболеваний как атеро­склероз, ишемическая болезнь сердца (ИБС), остеопороз, диабет, бронхиальная астма, опухоли и пр. Сочетания аллельных вариантов различных генов, вовле­ченных в развитие каждой конкретной патологии, получили название «генных се­тей». В каждой из таких сетей выделяют главные (цент­ральные) гены, и дополнительные (вспомогательные) гены, называемые также генами-модификаторами.

Составление генной сети для каждого мультифакториального заболевания, идентификация в ней центральных генов и генов-модификаторов, анализ ассо­циации их полиморфизмов с конкретным заболеванием, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента соста­вляют основу предиктивной (предсказательной) медицины.

В настоящее время в клинической практике применяются около 150—200 генетических тестов и раз­работаны панели генетических тестов для многих наиболее частых мультифакториальных болезней.

Гены внешней среды (гены детоксикации). Гены детоксикации кодируют разнообразные ферменты, ответственные за ме­таболизм, деграда-цию, детоксикацию и выведение ксенобиотиков.

Именно эти гены, точнее их полиморфные варианты, определяют индивиду­альные особенности реакции организма на различные химические препараты и пищевые продукты. Генетические полиморфизмы, приводящие к полному отсут­ствию соответствующего белка, либо к появлению ферментов с измененной, как правило, более низкой, чем в норме, активностью, и являются причиной выра­женной индивидуальной вариабельности реакций организма на лекарственные препараты, промышленные загрязнения, гербициды и пр.

Большинство ксенобиотиков, попадая в организм, не оказывают прямого биологического эффекта, но подвергаются различным превращениям, так назы­ваемой биотрансформации, которая является трехэтапным процессом, включа­ющим активацию (фаза 1), детоксикацию (фаза 2) и выведение (фаза 3) (рис.7). Гены, кодирующие ферменты биотрансформации, характеризуются значи­тельным полиморфизмом и обнаруживают существенные популяционные, этнические и расовые вариации, связанные с ис­торически сложившимися традициями, различиями продуктов питания, геогра­фической среды обитания, эпидемиями и пр. Типичными представителями фазы 1 являются гены системы цитохромов, фазы 2 — гены семейства трансфераз. Некоторые из этих генов и их по­лиморфизмы приведены в табл. 1.

Высокая активность различных цитохромов (фаза 1) в сочетании с низкой или нормальной активностью ферментов фазы 2 является наиболее неблагоприят­ным вариантом, при этом риск развития заболевания или патологического состо­яния резко возрастает.

Рисунок 7-Основные фазы детоксикации [1]

Так, высокая активность ферментов фазы I детоксикации (CYP1A1, CYP1A2, CYP1 Bl, CYP3A4, CYP2A6) предрасполагает к раку легких (особенно у курящих индивидуумов), а также к раку мочевого пузыря и толстого кишечника. Повы­шенная активность CYP1A2 может быть индуцирована табачным дымом, пере­жаренным мясом, некоторыми лекарствами (полибромидные бифенилы), а так­же диоксином. При некоторых вирусных заболеваниях также проис­ходит повышение активности этого цитохрома. Столь же пагуб­ные последствия для здоровья могут иметь и патологические аллели генов эпоксидгидролаз (фаза 1). Так, отмечено, что лица, гомозиготные по «медленной» форме микросомальной эпоксидгидролазы (тЕРХН), составляющие до 6% насе­ления России, обнаруживают высокую чувствительность к действию табачного дыма, различных оксидантов, ксенобиотиков с повышенной продукцией свобод­ных радикалов. У них чаще, чем в популяции, встречаются заболевания легких, в том числе эмфизема, хронические обструктивные пневмонии, а при наличии мутаций в гене CFTR заболевание муковисцидозом протекает особенно неблаго­приятно.

Неполноценный (нулевой) аллель глутатион-5-трансферазы (GSTM1), не слу­чайно ассоциирован с раком легких, хроническим обструктивным бронхитом, раком мочевого пузыря и даже с таким частым мультифакториальным заболева­нием как эндометриоз. На фоне алкоголизма у гомозигот GSTM10/0 чаще развивается цирроз печени. Имеются многочисленные данные о предрасположенности лиц, гомозиготных по «ослабленному» аллелю гена GSTP1 к различным опухолям, в том числе к раку кожи, а также к болезни Паркинсона.

Таблица 1 – Гены детоксикации

Генетический полиморфизм гена NAТ-2, ответственного за синтез фермента N-ацетилтрансферазы 2, может существенно влиять на возникновение рака мо­лочной железы. Этот эффект находится в прямой зависимости от курения. У женщин, гомозиготных по медленному аллелю этого гена (медленные «ацетиляторы»), курение увеличивает почти в 20 раз риск развития рака молочной железы. В то же время у курящих женщин, относящихся к группе быстрых «ацетиляторов», такой законо­мерности не отмечается.

Таким образом, по крайней мере, некоторые аллели генов «внешней среды» ассоциированы, а возможно, и непосредственно вовлечены в возникновение ря­да онкологических и иных заболеваний.

Гены мембранных рецепторов. Поступление ксенобиотиков в организм, равно как и всякие межклеточные взаимодействия регулируются рецепторным аппаратом клеточных мембран. Для многих генов рецепторных белков показано наличие полиморфизмов, а для не­которых доказано неблагоприятное фенотипическое проявление некоторых аллельных вариантов. В частности, функционально ослабленный аллель гена рецептора витамина D3 (VDR3) может предрасполагать к остеопорозу — за­болеванию, возникающему при снижении минеральной плотности костей и при­водящему к увеличению вероятности переломов. Аллели с низким числом CAG повторов в гене адренорецептора (AR) ассоциированы с раком предстательной железы. Тестирование мужчин по данному полиморфизму полезно для выявления лиц с генетической предрасположенностью к раку простаты задолго до начала заболевания, что позволяет более рационально орга­низовать его профилактику.

Делеция 32-х нуклеотидов в гене CCR5, ответственном за синтез кофактора рецептора CD4 (рецептор CD4 служит основным входом для штаммов вируса ВИЧ-1 в клетки макрофагов и моноцитов), приводит к возникновению мутантного белка с несколько измененными функциями. Белок, несущий делецию, приводит к существенному затруднению проникновения патогенного вируса иммунодефицита человека в клетки у гетерозиготных носителей мутации, или полностью блокирует проникновение — у гомозиготных носителей делеции. Вы­сокая частота (до 14%) этого аллеля в одних популяциях и крайне низкая — у дру­гих, может иметь существенное значение в плане организации рациональной профилактики пандемии СПИДа.

Гены-триггеры. К тяжелым мультифакториальным заболеваниям могут приводить мутации в генах, играю­щих ключевую роль в поддержании клеточного гомеостаза, которые названы генами- триггерами мультифакториальных болезней. Имен­но к этой группе отнесены многочисленные онкогены, а также гены онкосупрессоров (например, р53), следствием мутаций которых является активация соответствующих онкогенов и включение цепи метаболических реакций, приво­дящих, в конечном счете, к злокачественной трансформации клеток. Для многих десятков таких генов уже идентифицированы неблагоприятные аллельные вари­анты, предрасполагающие к заболеваниям.

Так, термолабильный вариант ключевого фермента синтеза цистеина — метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), ассоциирован с предрасположенно­стью к атеросклерозу и ишемической болезни сердца, с врожденными дефектами заращения невральной трубки, а также с нерасхождением хромосом в женском мейозе, приводящем к болезни Дауна.

Дефектный ген ангиотензинконвертирующего фермента (АСЕ) ассоциирован с развитием гипертрофии миокарда и гладкой мускулатуры сосудов, а также со­стоянием инсулинорезистентности, что имеет существенное значение в генезе эссенциальной гипертензии, инфаркта миокарда, инсулиннезависимого сахар­ного диабета, диабетической нефропатии и другой сосудистой патологии. Один из аллелей (Е4) гена аполипопротеина Е (АроЕ) ассоциирован не только с пред­расположенностью к атеросклерозу, но и с болезнью Альцгеймера, хореей Гентинттона, некоторыми другими нейродегенеративными заболеваниями.

В последние годы были идентифицированы мутантные аллели гена СС16, предрасполагающие в гомозиготном состоянии (10% населения) к астме; мута­ции в гене фактора V свертывания крови резко увеличивают вероятность тромбо­зов; аллельные полиморфизмы гена TGF2 коррелируют с такими частыми анома­лиями внутриутробного развития как расщелина верхней губы (заячья губа) и твердого неба (волчья пасть). Группа известных триггеров мультифакториальных заболеваний сегодня насчитывает более 50 генов и быстро увеличивается.

Наиболее опасным для возникновения многих болезней является сочетание неблагоприятных аллелей нескольких генов с аддитивным эффектом. В частно­сти, индивидуумы с неблагоприятными аллелями генов микросомальной эпоксидгидролазы, СС16, интерлейкинов 4 и 9, а также альфа-1-антитрипсина имеют особенно высокий риск хронических пневмоний, обтурационных бронхитов, эмфиземы легких и астмы.

Особенно сложен генетический ме­ханизм возникновения наиболее распространенных мультифакториальных забо­леваний, таких как диабет, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, боль­шинство онкологических и нервно-психических заболеваний. Считают, что этиология и патогенез этих заболеваний зависят от неблагопри­ятного сочетания всех трех основных вариантов генов предрасположенности, т.е. проявления патологических мутаций соответствующих основных генов модифи­цируются эффектами генов-триггеров, генов детоксикации и генов рецепторов.

В заключение необходимо подчеркнуть, что 1) тестирование генов предраспо­ложенности носит вероятностный характер. Оно не устанавливает диагноз, но выявляет лиц с повышенным риском развития той или иной патологии; 2) с по­мощью соответствующих мер и рекомендаций можно уберечь их от этих заболе­ваний; и 3) только наличия неблагоприятных аллелей недостаточно для разви­тия заболевания.

6. Генетический паспорт

В настоящее время во многих диагностических центрах России широко при­меняются молекулярные методы с целью диагностики генных болезней, выявле­ния гетерозиготного носительства патологических мутаций в семьях высокого риска, для досимптоматической диагностики болезней с поздней манифестаци­ей и с целью идентификации личности (геномной дактилоскопии). Постепенно набирает силу генетическое тестирование в рамках предиктивной (предсказа­тельной) медицины. Очевидно, что в результате этих исследований происходит накопление генетических данных как о геноме отдельных индивидуумов, так и о целых семьях, т.е. постепенно формируются индивидуальные и семейные базы ДНК-данных. Такая база ДНК-данных и является «генетическим паспортом». Ин­формация, содержащаяся в этом уникальном документе, позволит учесть индивидуаль­ные особенности своего генома, полнее реализовать свои врожденные способности и представляет несомненную ценность для потомков.

Черновой вариант генетического паспорта (персональная генетическая форма) уже существует de facto, и число генетических тестов, составляющих его основу, быстро увеличивается (рис. 7).

Важно отметить, что генетическая карта в полном варианте должна включать результаты исследования не только генов предрасположенности, но и бессимптом­ного носительства мутаций генов наиболее частых наследственных болезней (ге­мофилии, муковисцидоза, фенилкетонурии и др.). Кроме того, такой паспорт должен содержать информацию о кариотипе пациента, а также его уникальный генетический номер. В настоящее время диагностические возможности сущест­вующих молекулярных лабораторий и центров России позволяют обеспечить достаточно полный набор таких генетических тестов. Один из вариантов «генетического паспорта», разработанного в лаборато­рии пренатальной диагностики наследственных болезней НИИАГ им. Д.О. Отта РАМН, приведен на рис. 8.

Рисунок 7 – Персональная генетическая форма

В ближайшем будущем такой генетический паспорт может быть рекомендо­ван к применению в клинической практике, а генетическое тестирование станет столь же рутинным, как и другие лабораторные анализы (определение группы крови и резус-фактора, тесты на инфекционные болезни и пр.).

Согласно рекомендациям ВОЗ, генетическое тестирование должно прово­диться с учетом добровольного, сознательного согласия тестируемого. Формально это означает, что важная генетическая информация может быть получена сравнительно поздно, когда ее полезность для обследуемого и его близких родст­венников уже в значительной мере утрачена. Однако, принимая во внимание значение этих данных для здоровья ребенка, гармоничного формирования его личности, рационального питания, эффективного образования, спортивных за­нятий, оптимальной профориентации и пр., составление такого генетического паспорта в раннем возрасте представляется вполне оправданным уже сегодня.

Рисунок 8 – Предполагаемый генетический паспорт

Весьма актуальным представляется генетическое тестирование для будущих супругов, спортсменов - профессионалов, людей экстремальных профессий и лиц, просто заинтересованных в информации о собственном геноме.

7. Геномная дактилоскопия

Изменчивость числа повторяющихся последовательностей ДНК человека служит основой для метода «отпечатков пальцев». Этот метод сегодня приме­няется в самых разных целях, от установления отцовства и нужд судебной медицины до выявления контрафактных мясных продуктов, в том числе китобойного промысла.

Минисателлиты и VNTR. Одна из наиболее важных для практики форм полиморфизма ДНК основана на изменчивости числа тандемно повторяющихся последовательностей между двумя сайтами рестрик­ции. Эти последовательности длиной 2—100 нуклеотидов представляют собой мини-сателлиты. Например, последовательность GGAAGGGAAGGGAAGGGAAG состоит из четырех тандемных повторов последовательности GGAAG. Кластеры та­ких последовательностей широко распространены в геноме человека. Обычно каж­дый повтор содержит от 14 до 100 нуклеотидов, а число повторов в каждом сайте варь­ирует от 2 до 100 и более. Эти локусы, называемые варьирующие по числу тандемные повторы (VNTR), рассматриваются в геномике человека как пример среднеповторяющихся пос­ледовательностей ДНК. Участки ДНК с разным количеством повторов представляют собой аллели VNTR. Многие локу­сы включают десятки аллелей, часто встречаются гетерозиготы.

Когда VNTR-последовательности разрезаются с помощью рестриктаз и анализи­руются при помощи Саузерн-блоттинга, выявляется специфическая картина распределения полос. Эта картина - один из примеров «отпечатков пальцев» ДНК.

Подобные картины - эквивалент подлинных отпечатков пальцев, так как они все­гда неизменны для данного индивида (вне зависимости от того, какая ткань исполь­зуется как источник ДНК) и различаются у разных индивидов. Фактически изменчи­вость распределения полос столь велика, что их профиль для каждого человека уникален. Метод «отпечатков пальцев» может быть использован при наличии очень маленького количества материала (менее 60 мкл крови) и для проб, имеющих боль­шой возраст (удалось определить VNTR-профиль египетских мумий возрастом более 2400 лет), что повышает эффективность метода в различных обстоятельствах.

Применение VNTR-анализа в криминалистике. С 1988 г. в США результаты изучения ДНК с помощью метода «отпечатков пальцев» принимаются в качестве улик в криминалистике. Метод используется также для мно­гих других целей, в том числе, для идентификации личности при иммиграции, под­тверждения чистопородности собак, установления отцовства и исследований, связан­ных с охраной редких видов. Стандартное криминалистическое тестирование включает определение около десяти VNTR-локусов, которые находятся в разных хромосомах (рис. 9).

Рисунок 9 – Отпечатки пальцев ДНК в судебном деле. Профиль ДНК подозреваемого (S2) совпадает с профилем пробы крови, полученным в качестве улики (Е)

Результаты интерпретируются с помощью методов статистики, теории вероятностей и популяционной генетики. Частоты каждого аллеля в стандартном наборе VNTR-проб определены для многих популяций людей в разных регионах мира. С помощью этих данных можно рассчитать вероят­ность любой комбинации аллелей. Например, если определенный аллель в локусе 1 имеется у одного из 333 индивидов, а аллель в локусе 2 - у одного из 83, то вероят­ность их совместного присутствия в генотипе - 1/28000 (произведение их частот в популяции). Эта средняя вероятность не особенно доказательна, но если включить анализ аллеля третьего локуса (который имеется у 1 из 23 индивидов) и четвертого (имеется у 1 из 100 индивидов), то вероятность их комбинации — 1 из 70 миллионов. То есть вероятность, что кто-либо имеет именно эту комбинацию аллелей - 1/70000000, или всего 2 индивида на все население России.

Если «отпечатки пальцев» ДНК подозреваемых не совпадают с данными веществен­ных доказательств, эти люди могут быть исключены из числа предполагаемых пре­ступников (что происходит примерно в 30% случаев). Если найдено совпадение меж­ду ДНК, обнаруженной на месте преступления, и ДНК подозреваемого, то существует две возможных интерпретации: или ДНК оставлена на месте преступления подозре­ваемым, или кем-либо еще, имеющим такую же картину полос. В данном случае «от­печатки пальцев» ДНК не доказывают, что подозреваемый виновен, но являются од­ним из фрагментов обшей картины, составляющей доказательную базу, который должен рассматриваться наряду с другими фактами.