Методы исследования ДНК

Сбор образцов. Чаще всего в качестве образца используют кровь больного. Необходимо помнить, что кровь для ДНК-диагностики собирают
в отдельную пробирку с антикоагулянтом ЭДТА, но не гепарином. Соскоб со слизистой оболочки
ротовой полости или слюна — также достаточный материал для определения любых изменений в ДНК. Кроме того, ДНК остается стабильной после высушивания образцов
крови, что позволяет направлять их для анализа почтой в другие города и даже страны, а также обращаться к архивным материалам и биопсийным препаратам. Образцы
тканей или ДНК можно замораживать для длительного хранения.

В основе большинства применяемых в клинической практике молекулярно-генетических тестов лежит ПЦР. Далее амплифицированную ДНК анализируют
с помощью различных методов.

Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов. Один из самых простых молекулярно-генетических методов — анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов. Метод не предъявляет требований к условиям ПЦР, а продукты амплификации можно анализировать с
помощью электрофореза в агарозном или акриламидном геле. Праймеры для ПЦР
подбирают относительно легко, но так, чтобы с двух сторон ограничивать область
полиморфизма. После проведения ПЦР продукты амплификации наносят на гель и проводят электрофорез в присутствии маркеров длины нуклеотидных фрагментов. Метод позволяет получать результат в течение
3-4 ч с момента доставки образца в лабораторию.

Это исследование позволяет определять небольшие вставки и делеции, а
также различия в числе тандемных повторов (полиморфизм VNTR — variable
number of tandem repeats), что используют в судебно-медицинской практике, при
определении родства и при болезнях экспансии повторов. В настоящее время
распространена модификация метода — количественная флюоресцентная ПЦР.
Добавление флюоресцентных красителей к праймерам и использование капиллярного электрофореза позволяет проводить мультиплексные реакции с количественной оценкой амплификата. Этот метод применяют в пренатальной диагностике
для определения анеуплоидии, делеций и вставок, где он заменяет трудоемкие
цитогенетические методы.

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Этот метод часто применяют для обнаружения однонуклеотидных замен. После амплификации в ПЦР фрагмента ДНК, содержащего место возможной замены нуклеотида, амплификат обрабатывают ферментом (рестриктазой). Благодаря
специфичности действия рестриктазы, узнающей определенную короткую (обычно — от 4 до 6 букв) нуклеотидную последовательность, можно подобрать такие
ферменты, которые будут разрезать только дикий или только мутантный тип
аллеля. Продукты рестрикции разделяют с помощью электрофореза. По образованию полос в геле, соответствующих коротким, длинным или и тем, и другим
фрагментам, определяют соответственно один и другой гомозиготный вариант
или гетерозиготное состояние по данному аллелю (рис. 3).

Недостаток метода — существование дополнительной процедуры — рестрикции,
удлиняющей время исполнения анализа до 3-24 ч в зависимости от протокола
обработки рестриктазой. Кроме того, не во всех случаях однонуклеотидных замен
удается подобрать специфичный для этого локуса фермент. Тем не менее, метод
оценки ПДРФ — один из распространенных в диагностике, так как хорошо различает однонуклеотидные полиморфизмы, широко распространенные как при
моногенных, так и при многофакторных заболеваниях.

Аллельспецифичная полимеразная цепная реакция - один из распространенных методов анализа точковых мутаций. Праймеры подбирают так, чтобы они оканчивались точно в месте
мутации. В таком случае специфичность их взаимодействия с матрицей зависит от
существования или отсутствия мутации (рис. 4). К сожалению,
полимераза, используемая в ПЦР, часто продолжает работу даже при неполной
комплементарности, что приводит к получению ложноположительных результатов ПЦР. В настоящее
время метод чаще применяют в научно-исследовательских целях, а не в прикладных
диагностических.

Рисунок 3- Схема рестрикции и электрофореза образцов при проведении анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов [1]

Количественная полимеразная цепная реакция. С помощью добавления в смесь для ПЦР молекул, которые способны флюоресцировать при наработке продукта амплификации, удается не только чувствительность и специфичность реакции, но и получить точную количественную оценку содержания искомой матрицы в образце, а также в значительной
степени ускорить и упростить протокол проведения анализа. Наибольшее распространение получили две разновидности количественной ПЦР (ПЦР в реальном времени). В первом случае в смесь добавляют флюорофор, который неспецифически
взаимодействует с двойной спиралью ДНК и при этом многократно увеличивает
уровень флюоресценции. Этот вариант отличается простотой оптимизации условий и дешевизной.

Рисунок 4- Схема аллельспецифичной ПЦР [1]

Во втором случае в смесь добавляют зонд — олигонуклеотид, специфичный для
последовательности, которую амплифицируют (рис. 5). При
прохождении реакции все большие его количества взаимодействуют с образующейся искомой ДНК. При этом полимераза в ходе своей работы разрушает зонд
и высвобождает связанный с ним флюорофор, который начинает светиться. Чем
больше синтезировано ПЦР-продуктов, тем более интенсивна флюоресценция.

Преимущество метода заключается в возможности использования разных флюорофоров для различных зондов и проведении нескольких реакций в одной пробирке. Количественная ПЦР не требует выполнения дополнительных процедур
(например, электрофореза), что не только сокращает время проведения анализа,
но и существенно снижает риск контаминации, так как флюоресценцию образцов
анализируют в закрытых пробирках.

С помощью количественной ПЦР можно определять большой перечень мутаций: протяженные и небольшие делеции, однонуклеотидные полиморфизмы и
дупликации, в том числе целых хромосом (анеуплоидии). В целом можно сказать, что количественная ПЦР в диагностике занимает самые
прочные позиции, благодаря сочетанию высокой специфичности, чувствительности и скорости проведения анализа. В лабораториях с большим потоком анализов
этим методом по возможности заменяют любые другие исследования, в том числе
не требующие количественной оценки, поскольку его применение позволяет снизить риск контаминации образцов.

Рисунок 5- Схема количественной ПЦР в варианте с зондом [1]

Мультиплексная лигазозависимая амплификация (распространенный вариант в русскоязычной литературе без перевода — MLPA — multiple ligase
dependent probe amplification) — относительно новый, дешевый, высокопроизводительный и специфичный метод анализа широкого спектра мутаций — однонуклеотидных полиморфизмов, небольших и крупных делеций. В основе метода лежит специфичное лигирование двух олигонуклеотидных
проб (рис. 6), подобранных таким образом, что исследуемая мутация лежит
на их стыке. Лигирование с помощью специальной высокоспецифичной лигазы 
происходит с очень высокой точностью, обеспечивающей распознавание комплементарного нуклеотида. При этом в каждую пробу вводят различную по длине
маркерную последовательность, чтобы различать отдельные аллели, а концы проб
замыкают универсальными праймерами. В результате амплификации лигированных проб получают набор продуктов с длинами, соответствующими различным
аллелям. В одной реакции без труда можно анализировать десятки аллелей, если
продукты амплификации подвергать капиллярному электрофорезу. Более того,
амплитуда пиков при капиллярном электрофорезе — высоковоспроизводимая
характеристика набора ампликонов, что дает возможность определять дозу гена —
диагностировать потерю гетерозиготности или, напротив, амплификацию гена,
в целом метод применим для диагностики большинства мутаций: замены, делеции
и вставки (как однонуклеотидной, так и протяженной). Он также находит применение в пренатальной диагностике анеуплоидии.

Секвенирование — «золотой стандарт» молекулярной генетики, с его помощью
можно провести поиск новых, редких и подтверждение известных мутаций. Диагностика
многих наследственных заболеваний включает
проведение секвенирования: предрасположенность к раку яичников и молочной железы
(ВЕСА1 и ВКСА2), нейрофиброматоз, фенилкетонурия, муковисцидоз и др. При отсутствии
распространенных мутаций, приводящих к
наследственному заболеванию, часто секвенируют ген для обнаружения более редких
или новых мутаций.

Рисунок 6 - Схема мультиплексной лигазозависимой амплификации [1]

Для некоторых генов,
имеющих небольшие размеры, прямое секвенирование с успехом применяют в качестве основного метода сканирования мутаций. Например, удобным оказалось его применение
для определения мутаций в гене фактора IX
свертывания крови (гемофилия В). Один из
существенных недостатков технологии секвенирования — его дороговизна, но из года в год
снижать его стоимость позволяет применение
новых методик.

Масс-спектрометрия. Для молекулярно-генетического
анализа на масс-спектрометре подбирают
 олигонуклеотиды встык к исследуемому полиморфизму, после чего их наращивают на один нуклеотид, комплементарный
изучаемому. Масс-спектрометр позволяет быстро и точно определить добавленный нуклеотид. Для проведения анализа также требуются предварительная
амплификация последовательности в ПЦР и последующая очистка амплификата
перед гибридизацией со специфической пробой. Дополнительные процедуры и
использование специальных реагентов становятся оправданными при проведении
большого количества однотипных тестов. Этот метод позволяет оценивать однонуклеотидные замены и небольшие делеции и вставки. Кроме того, оценка соотношения множества пиков полиморфизмов в гетерозиготном состоянии позволяет
обнаруживать анеуплоидию. Производительность прибора составляет сотни анализов в сутки.

Биологические микрочипы заняли свою нишу в основном в научных исследованиях, но используются и диагностике. Чипы — небольшие (2-10 см²) полимерные или стеклянные пластины либо
мембраны, на которые нанесено от сотен до десятков тысяч различных биологических проб: ДНК, РНК, белки или клетки. В зависимости от этих зондов различают
ДНК-, РНК-, белковые и клеточные микрочипы. Наибольшее распространение
получили ДНК-чипы. Их используют для анализа спектра мутаций или аллельных вариантов разных генов, а также для анализа экспрессии генов.

Микрочиповая
 технология за счет экономии реактивов и пространства позволяет проводить тысячи анализов одновременно с использованием минимальных количеств материала (например, изучать экспрессию десятков генов в образце опухолевой ткани при определении
прогноза лечения). С помощью ДНК-чипов можно анализировать как протяженные, так и короткие транслокации, дупликации и делеции.

Технология приготовления микрочипов в настоящее время коммерциализирована, и многочисленные фирмы (в том числе в России) могут по заказу подготовить любой вариант чипа. Интерес к использованию микрочипов в клинической практике связан, в частности, с поиском ассоциаций генетических полиморфизмов с заболеваниями и
использованием этой технологии в предсказательной медицине. Биологические
чипы создают для диагностики конкретных заболеваний, поиска полиморфных
систем генов детоксикации и фармакогенетически оправданного лекарственного
лечения лейкозов, туберкулеза и бронхиальной астмы.

Метилспецифичная полимеразная цепная реакция. В ряде случаев причиной заболевания служит не изменение нуклеотидной
последовательности генов, а сбой регуляторных механизмов реализации программы генома. Среди так называемых эпигенетических причин дисфункции наиболее
широко известны нарушения метилирования СрG-динуклеотидов в регуляторных,
часто промоторных, областях различных генов. Чаще всего такие изменения возникают в злокачественных опухолях. Среди наследственных синдромов, вызванных ошибками метилирования, наибольшую известность получили синдромы
Прадера-Вилли, Ангельмана и Беквита-Видеманна.

Суть метилспецифичной реакции состоит в том, что ДНК обрабатывают бисульфитом натрия, в результате чего все неметилированные остатки цитозина конвертируются в урацил, а метилированные не изменяются. После этого проводят ПЦР
с праймерами, соответствующими метилированной и неметилированной последовательностям. По тому, с какой парой праймеров происходит амплификация,
можно судить о метилировании. Этот метод относительно дешев и прост. Он нашел применение в
диагностике злокачественных новообразований и болезней импринтинга.

Метилчувствительная полимеразная цепная реакция. В ряде случаев в области изучаемого СрG-динуклеотида можно найти последовательность, распознаваемую особыми ферментами — метилчувствительными
рестриктазами. В отличие от обычных рестриктаз активность этих ферментов
зависит от состояния метилирования СрG-динуклеотида, входящего в состав специфичной для фермента последовательности. При метилировании ДНК становится устойчивой к действию фермента.

Бисульфитный сиквенс. Проводится обработка ДНК бисульфитом с последующим секвенированием, что позволяет выявлять метилированные нуклеотиды в масштабах всего генома. 
Прогнозируется развитие новых методов диагностики уровня
метилирования генов на основе не только секвенирования, но и микрочиповых
технологий.

Методы мутационного скрининга. Если характер мутации неизвестен, а клиническая картина заболевания позволяет предположить, в каких генах могла произойти мутация, то в лабораторной
диагностике наследственных болезней нередко прибегают к разработке индивидуальной (семейной) диагностической процедуры и применяют комплекс исследовательских методов поиска новых мутаций, в том числе анализ перестроек ДНК-блоттингом по Саузерну; анализ полиморфизма конформации одноцепочной ДНК; гетеродуплексный анализ и др.

В настоящее время разрабатывают методы неинвазивной пренатальной молекулярно-генетической диагностики. В этом случае в качестве материала для анализа используют кровь матери (ткани плода при заборе материала не затрагивают),
которая во время беременности содержит не только плодные клетки, но и внеклеточные ДНК и РНК плода. Такое тестирование требует использования современного высокопроизводительного оборудования, позволяющего анализировать
миллионы генных последовательностей. Это поможет распознать и правильно
генотипировать молекулы плода, составляющие лишь 4-10% общей внеклеточной ДНК.

С этой целью применяют системы параллельного секвенирования или
масс-спектрометрии. В ноябре 2011 г. состоялся запуск коммерчески доступной неинвазивной пренатальной диагностики синдрома Дауна компанией «Секвеном»
(США). Тест основан на технологии массового параллельного секвенирования.
Учитывая экспоненциальное удешевление секвенирования наряду с повышением
его точности и скорости, в ближайшие три года можно предполагать создание коммерчески доступных неинвазивных пренатальных тестов как на распространенные
хромосомные, так и генные заболевания. Другая задача, с которой могут справиться системы параллельного секвенирования, — просеивающее тестирование новорожденных.

В настоящее время в России с помощью
этого тестирования определяют пять заболеваний новорожденных: фенилкетонурию, муковисцидоз, адреногенитальный синдром, врожденный гипотиреоз и галактоземию. Во всех случаях в качестве первого метода используют биохимический
анализ крови новорожденного. В случае подозрения проводят ДНК-диагностику.


Развитие технологий секвенирования позволит не только существенно расширить перечень диагностируемых заболеваний,
но и сократить в конечном итоге стоимость неонатального тестирования.