Трансаминирование аминокислот

Под трансаминированием подразумевают реакции межмолекулярного переноса аминогруппы (NH₂) от аминокислоты на ос-кетокислоту без промежуточного образо­вания аммиака. Впервые реакции трансаминирования (прежнее название переамини-рование) были открыты в 1937 г. советскими учеными А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман при изучении дезаминирования глутаминовой кислоты в мышечной ткани. Было замечено, что при добавлении к гомогенату мышц глутаминовой и пировиноградной кислот образуются а-кетоглутаровая кислота и аланин без проме­жуточного образования аммиака; добавление аланина и а-кетоглутаровой кислоты соответственно приводило к образованию пировиноградной и глутаминовой кислот.

Реакции трансаминирования являются обратимыми и, как выяснилось позже, универсальными для всех живых организмов. Эти реакции протекают при участии специфических ферментов, названных А. Е. Браунштейном аминоферазами (по совре­менной классификации аминотрансферазы или т р а н с а м и н а з ы). Теорети­чески реакции трансаминирования возможны между любой амино- и кетокислотой, однако наиболее интенсивно они протекают в том случае, когда один из партнеров представлен дикарбоновой амино- или кетокислотой. В тканях животных и у микро­организмов доказано существование реакций трансаминирования между монокарбо-новыми амино- и кетокислотами. Донорами NH₂-rpynnbi могут также служить не только ос-, но и (3-, у-, 8- и со-аминогруппы ряда аминокислот. В лаборатории А. Майстера доказано, кроме того, трансаминирование глутамина и аспарагина с ке­токислотами в тканях животных.

В переносе аминогруппы активное участие принимает кофермент трансами-наз — пиридоксальфосфат (производное витамина В₆; см. главу 5), который в про­цессе реакции обратимо превращается в пиридоксаминфосфат.

Механизм реакции трансаминирования. Общую теорию механизма ферментатив­ного трансаминирования разработали советские ученые А. Е. Браунштейн и М. М. Ше­мякин. Одновременно подобный механизм был предложен американским биохими-

ком Э. Снеллом. Все трансаминазы (как и декарбоксилазы аминокислот) содержат один и тот же кофермент — пиридоксальфосфат. Для реакций трансаминирования характерен общий механизм. Специфичность трансаминаз обеспечивается белковым компонентом. Ферменты трансаминирования катализируют перенос NH₂-rpynnbi не на а-кетокислоту, а сначала на кофермент — пиридоксальфосфат; образовавшееся промежуточное соединение (шиффово основание) подвергается внутримолекулярным превращениям (лабилизация ос-водородного атома, перераспределение энергии связи), приводящим к освобождению а-кетокислоты и пиридоксаминфосфата; последний на второй стадии реакции реагирует с любой другой ос-кетокислотой, что через те же стадии образования промежуточных соединений (идущих в обратном направлении) приводит к синтезу новой аминокислоты и освобождению пиридоксальфосфата. Опуская промежуточные стадии образования шиффовых оснований, обе стадии реак­ции трансаминирования можно представить в виде общей схемы:

Детальный механизм действия трансамЧшат Представлен на рис. 11.2.

В связи с тем, что во всех пиридоксалевых ферментах (включая трансаминазы) карбо­нильная группа кофермента (—СНО) оказалась связанной с е-аминогруппой лизина белковой части, в классический механизм реакции трансаминирования А. Е. Браунштейн и Э. Снелл внесли следующее дополнение. Оказалось, что взаимодействие между субстратом, т. е. L-аминокисло-

той (на схеме аспартат) и пиридоксальфосфатом, происходит не путем конденсации с выде­лением молекулы воды, а путем реакции замещения, при которой NH₂-rpynna субстрата вытесняет e-NH₂-rpynny лизина в молекуле ферментного белка, что приводит к формирова­нию пиридоксальфосфатного комплекса.

Существование представленного механизма реакции трансаминирования доказа­но разнообразными методами, включая методы спектрального анализа по иденти­фикации промежуточных альдиминных и кетиминных производных пиридоксаль-фосфата.

Роль трансаминаз и реакций трансаминирования в обмене аминокислот. Чрезвы­чайно широкое распространение трансаминаз в животных тканях, у микроорганизмов и растений, их высокая резистентность к физическим, химическим и биологическим воздействиям, абсолютная стереохимическая специфичность по отношению к L-ами-нокислотам, а также высокая каталитическая активность в процессах трансаминиро­вания послужили предметом детального исследования роли этих ферментов в обмене аминокислот. Выше было указано, что при физиологических значениях рН среды активность оксидазы L-аминокислот резко снижена. Учитывая это обстоятельство, а также высокую скорость протекания реакции трансаминирования, А. Е. Браунштейн выдвинул гипотезу о возможности существования в животных тканях непрямого пути дезаминирования аминокислот через реакции трансаминирования, названного им процессом трансдезаминирования. Основой для выдвижения этой гипо­тезы послужили также данные Г. Эйлера о том, что в животных тканях из всех природных аминокислот с высокой скоростью дезаминируется только L-глутамино-вая кислота в реакции, катализируемой высокоактивной и специфической глутамат-дегидрогеназой.

Согласно этой гипотезе, получившей экспериментальное подтверждение, все или почти все природные аминокислоты сначала реагируют с ос-кетоглутаровой кислотой в реакции трансаминирования с образованием глутаминовой кислоты и соответству­ющей кетокислоты. Образовавшаяся глутаминовая кислота затем подвергается не­посредственному окислительному дезаминированию под действием 1лу1аматдегидро-геназы. Схематически механизм трансдезаминирования можно представить в следу­ющем виде:

Суммарная реакция при этом сводится к следующей:

R!-CH(NH₂)-COOH + НАД⁺ + Н₂О -> R,-CO-COOH + НАДН₂ + NH₃

Поскольку обе реакции (трансаминирование и дезаминирование глутаминовой кислоты) являются обратимыми, создаются условия для синтеза по существу любой аминокислоты, если в организме имеются соответствующие а-кетокислоты. Известно, что организм животных и человека не наделен способностью синтеза углеродных скелетов (а-кетокислот), так называемых незаменимых аминокислот; этой способ­ностью обладают только растения и многие микроорганизмы.

Механизм, при помощи которого в живых организмах осуществляется синтез природных аминокислот из а-кетокислот и аммиака, был назван А. Е. Браунштей-ном трансреаминированием. Сущность его сводится к восстановительному аминированию а-кетоглутаровой кислоты с образованием глутаминовой кислоты (реакцию катализирует НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа, работающая в ре­жиме синтеза) и к последующему трансаминированию глутамата с любой а-кето-

кислотой. В результате образуется L-аминокислота, соответствующая исходной кетокислоте, и вновь освобождается а-кетоглутаровая кислота, которая может акцеп­тировать новую молекулу аммиака. Роль реакций трансаминирования как в дезами-нировании, так и в биосинтезе аминокислот может быть представлена в виде следующей схемы:

Видно, что трансаминазы катализируют опосредованное через глутаматдегидро-геназу как дезаминирование природных аминокислот (красные стрелки), так и био­синтез аминокислот (черные стрелки).

Получены доказательства существования в организме теплокровных животных еще одного механизма непрямого дезаминирования L-аминокислот, при котором Глу, Асп и АМФ выполняют роль системы переноса NH₂-rpynnbi; гидролитическое дезаминирование АМФ приводит к образованию инозинмонофосфата (ИМФ) и аммиака:

ЬАМК->Глу->Асп->АМФ->ЫН₃

Возможно, что в аналогичной системе в качестве промежуточного переносчика ЫН₂-группы вместо АМФ участвует НАД.

Клиническое значение определения активности трансаминаз. Широкое распростра­нение и высокая активность трансаминаз в органах и тканях человека, а также сравнительно низкие величины активности этих ферментов в крови послужили осно­ванием для попыток определения уровня ряда трансаминаз в сыворотке крови человека при органических и функциональных поражениях разных органов. Для клинических целей наибольшее значение имеют две трансаминазы — АсАТ и АлАТ, катализирующие соответственно следующие обратимые реакции:

Аспартат + ot-Нетоглутарат ■«. Оксалоацетат+Глутамат Алании + а-Нетоглутарат «Пируват+Глутамат

В сыворотке крови здоровых людей активность этих трансаминаз в тысячи раз ниже, чем в паренхиматозных органах. Поэтому органические поражения при острых и хронических заболеваниях, сопровождающиеся деструкцией клеток, приводят к выходу трансаминаз из очага поражения в кровь. Так, при инфаркте миокарда уровень АсАТ сыворотки крови уже через 3-5 ч после наступления инфаркта резко повышается (в 20-30 раз). Максимум актив­ности обеих трансаминаз крови приходится на конец первых суток, а уже через 2 — 3 дня

при благоприятном исходе болезни уровень сывороточных трансаминаз возвращается к норме. Напротив, при затяжном процессе или наступлении повторного инфаркта миокарда наблю­дается новый пик повышения активности этих ферментов в крови. Этим объясняется тот факт, что в клинике трансаминазный тест используется не только для постановки диагноза заболевания, но и для прогноза и проверки эффективности метода лечения '. При гепатитах также наблюдается гипертрансаминаземия (за счет преимущественного повышения уровня АлАТ), но она имеет более умеренный и затяжной характер, и повышение трансаминазной активности в сыворотке крови происходит медленно. При различного рода коронарной недоста­точности (стенокардия, пороки сердца и др., кроме инфаркта миокарда) гипертансаминаземия или не наблюдается, или незначительна. Определение активности трансаминаз сыворотки крови при заболеваниях сердца следует отнести к дифференциально-диагностическим лабо­раторным тестам. Повышение уровня трансаминаз сыворотки крови отмечено, кроме того, при некоторых заболеваниях мышц, в частности при обширных травмах, гангрене конечностей и прогрессивной мышечной дистрофии.

Превращения ос-кетокислот. Образовавшиеся в процессе дезаминирования и трансдезаминирования ос-кетокислоты подвергаются в тканях животных различным превращениям, прежде всего восстановительному аминированию с образованием соответствующей аминокислоты. Это так называемый синтетический путь превраще­ния. Опыты с перфузией растворов ос-кетокислот и аммиака через изолированную печень показали, что в оттекающей из печени жидкости действительно открываются соответствующие исходным кетокислотам L-аминокислоты. Этот синтез протекает преимущественно по механизму трансреаминирования при участии трансаминаз. Существуют, кроме того, гликогенные, кетогенные и окислительные пути, ведущие к образованию соответственно глюкозы, жирных кислот, кетоновых тел и компо­нентов цикла трикабоновых кислот. Ниже эти процессы представлены в виде схемы:

Углеродные скелеты аминокислот могут включаться в ЦТК через следующие соединения: ацетил-КоА (некоторые опосредованно через ПВК, пируват), ЩУК (щавелевоуксусную кислоту, оксалоацетат), а-КГ (ос-кетоглутарат) и сукцинил-КоА.

Пять аминокислот (Фен, Лиз, Лей, Трп и Тир) считаются «кетогенными», поскольку они являются предшественниками кетоновых тел, в частности ацетоуксусной кисло­ты, в то время как большинство других аминокислот, обозначаемых как «гликоген-ные», служат в организме источником углеводов, в частности глюкозы. Подобный синтез углеводов de novo наблюдается при некоторых патологических состояниях, например при сахарном диабете, а также при гиперфункции коркового вещества надпочечников и введении глюкокортикоидов (см. главу 6). Такое разделение амино­кислот на кетогенные и гликогенные носит, однако, условный характер, поскольку некоторые углеродные атомы Лиз, Трп, Фен и Тир могут включаться в молекулы предшественников глюкозы, например Фен и Тир — в фумарат. Истинно кетогенный аминокислотой является только лейцин.