Анализа

Ферментативный анализ субстратов представляет собой метод с использованием в качестве реактивов ферментов, которые способ­ны в определенных условиях преобразовывать отдельные веще­ства (субстраты) с высокой специфичностью в продукты реакции. Субстраты, с которыми взаимодействуют ферменты, относятся к соединениям природного происхождения (например, сахара, орга­нические кислоты и их соли, спирты и др.), участвующим в про­цессах метаболизма живой клетки. Таким образом, методологи­ческую основу ферментативного анализа составляют природные биохимические механизмы процесса обмена веществ, отдельные реакции которого воспроизводятся с большой точностью в искус­ственных условиях с целью количественного определения суб­стратов в монопродуктах или продуктах со сложным составом. Для проявления высокоспецифичных свойств ферментов и полу­чения достоверного результата условия воспроизведения реакции максимально приближены к физиологическим условиям, сущест­вующим в живой клетке. В ходе ферментативной реакции должно быть достигнуто полное количественное преобразование исследу­емого субстрата.

Специфичность, т. е. избирательность действия ферментов, обеспечивает достоверность результата ферментативной реакции, протекающей в искусственных условиях, поскольку он не зави­сит от влияния соединений, которые имеют сходное с анализиру­емым компонентом строение и входят с ним в матрицу исследуе­мой пробы.

Ход ферментативной реакции и ее ответ на внесение в систему субстрата контролируют с помощью физических методов путем измерения изменений качественного и количественного состава вспомогательных соединений или процессов.

В дегидрогеназных ферментных системах в качестве вспомо­гательных соединений используют окисленные или восстанов­ленные формы коферментов NAD⁺/NADH, NADP⁺/NADPH. Эти коферменты участвуют в системе в качестве переносчиков во­дорода.

Количество окисленных коферментов NADH или NADPH стехиометрически соотносится с количеством анализируемого соеди­нения (рис. 11.1).

Изменение формы коферментов контролируют спектрофотометрическим измерением оптической плотности — экстинкции — системы при 334, 340 или 365 нм. В интервале длин волн от 334 до 365 нм (оптимум 340) восстановленная форма NADH или NADPH проявляет максимальное поглощение (рис. 11.2).

Конечный результат фер­ментативной реакции рассчи­тывают на основании закона Ламберта— Бера из полученных значений оптической плотно­сти восстановленной дегидрогеназной ферментной системы в начале и конце реакции.

В отдельных системах, например в определении сульфита, в ка­честве первичного фермента наряду с дегидрогеназами использу­ют оксидазы. В ходе окислительной реакции происходит перенос водорода от субстрата к кислороду с образованием пероксида во­дорода. Последний может быть преобразован двумя различными способами с помощью фермента пероксидазы или с помощью фермента NADH-пероксидазы и NADH.

В комбинированных ферментных системах (КФС) определение субстратов также основано на использовании специфичного дей­ствия ферментов. Однако результат определения рассчитывают, исходя из интенсивности окрашивания системы, измерение кото­рой проводят фотометрическим способом в видимой области спектра. В качестве вспомогательных соединений в КФС участву­ют акцепторы электронов.

В ферментной системе в качестве суммарного определения пищевых волокон проводят предварительный гидролиз пробы с помощью гидролаз — а-амилазы, протеазы, глюкоамилазы. Про­дукты реакции после промежуточных стадий очистки и концен­трирования определяют гравиметрическим способом.