Принцип действия ферментов и кинетика ферментативных реакций

Тысячи различных ферментативных реакций протекают в клет­ке согласованно и одновременно. Эти реакции могут происходить лишь в тех случаях, когда ферменты способны «узнавать» свой субстрат. Это свойство во многом определяет так называемый принцип «ключа и замка». Например, фермент глюкозооксидаза из нескольких Сахаров в среде «узнает» свой субстрат — глюкозу и кислород; в результате образуется фермент-субстратный комплекс из этих двух субстратов, а затем — продукты (глюконолактон и пероксид водорода). В этом случае можно говорить о высокой суб­стратной специфичности фермента. Однако в процессе эволюции возникли менее специфичные ферменты, например пепсин, кото­рый расщепляет в пищеварительном тракте все белки в местах со­единения совершенно определенных аминокислот (триптофан, фенилаланин, тирозин, метионин, лейцин).

У простых ферментов типа лизоцима каталитическое действие осуществляется таким образом: фермент влияет на конформацию субстрата и переводит его в напряженное состояние, способствую­щее протеканию реакции. Кроме того, в активном центре сосре­доточено много неполярных групп, и эта область действует как органический растворитель. В этой области находится небольшое число заряженных полярных боковых групп аминокислот, реак­ционная способность которых выше, чем ионов воды. Имея боль­шую гибкую молекулу, ферменты способны сосредоточить на не­большом участке необходимые группы для осуществления кон­кретной реакции с субстратом.

У сложных ферментов, имеющих простетические группы и коферменты, возможности взаимодействия с субстратом увеличива­ются. Во время катализа простетические группы отдают электро­ны, протоны или целые химические группы, а после каталитичес­кой реакции регенерируются.

Соединение фермента с субстратом в каталитическом центре может происходить с помощью ковалентных связей, при участии электронов, с помощью водородных связей или более слабых вза­имодействий, например сил Ван-дер-Ваальса. Для этого фермент и субстрат в районе каталитического центра должны сблизиться до расстояния 1,5—2 нм для ослабления внутренних связей в мо­лекуле субстрата.

В общем виде ферментативный процесс можно отразить следу­ющим уравнением:

Скорость всех ферментативных реакций зависит (при прочих равных условиях) от концентрации фермента и его субстрата.

Если концентрация субстрата [S] значительно выше концен­трации фермента [Е]_, скорость ферментативной реакции можно охарактеризовать уравнением Михаэлиса—Ментен:

Если [S] = К_т, скорость ферментативной реакции будет равна половине максимальной скорости. Численно К_т равна концентра­ции субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной. Графически зависимость между У_тгх и К_т пока­зана на рисунке 4.2.

В экспериментальных условиях неудобно работать с субстрата­ми высокой концентрации, поэтому используют другой метод оп­ределения кинетических характеристик фермента. Для этого урав­нение (4) преобразуют следующим образом:

Тогда V_max находят, откладывая по оси абсцисс значения 1/[S], а по оси ординат — 1/V.

Точка пересечения прямой K_m/V_max осью ординат (рис. 4.3) дает величину 1/ V_max, а с осью абсцисс — величину 1/К_т.

Измерив угол наклона а и отрезок на оси ординат, можно дос­таточно точно определить V_max и К_т.

Встречаются реакции других типов, например, обратимые с од­ним субстратом, необратимые с несколькими субстратами или реакции, в которых из одного субстрата образуются два продукта. В ходе этих реакций также происходит образование фермент-суб­стратных комплексов подобно тому, как это имеет место в односубстратных реакциях, и при исследовании кинетики этих реакций могут быть определены К_т для каждого из субстратов и V_max для реакции. Такие реакции осуществляются либо по последователь­ному типу, либо по типу пинг-понг, либо по смешанному.

Ферменты обладают очень высокой каталитической актив­ностью. Одна молекула фермента за 1 мин может прореагировать с тысячами и даже миллионами молекул специфического суб­страта.

Известно, что для действия каждого фермента характерна оп­тимальная температура, при которой скорость реакции макси­мальна. Оптимум температуры большинства используемых в биотехнологии ферментов микроорганизмов составляет 30...40 °С.

Оптимум действия одних ферментов, например пепсина, наблю­дается в кислой среде (рН 2), других — в щелочной, а у большин­ства ферментов — в нейтральной.

На действие ферментов могут оказывать влияние активаторы и ингибиторы. Активаторами многих ферментов являются цистеин и глутатион. Эти вещества восстанавливают дисульфидную связь, образуя SH-группы, которые входят в состав каталитических цен­тров и часто определяют ферментативную активность. Ингибито­ры ферментов могут быть неспецифическими (например, соли тя­желых металлов, которые при связывании с белками осаждают их из растворов) или специфическими (например, синильная кисло­та, которая реагирует с определенными химическими группами ферментов и ингибирует действие железосодержащих дыхатель­ных ферментов).

Различают три типа обратимого ингибирования ферментов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. Конкурент­ные ингибиторы способны обратимо связываться с активным центром фермента и конкурировать с субстратом за активный центр. При неконкурентном ингибировании взаимодействие ин­гибитора и фермента происходит не на том участке, с которым связывается фермент, но они вызывают изменение конформации фермента, нарушая таким образом нормальное взаимодействие активного центра с ферментом. Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда ингибитор обратимо взаимодей­ствует только с субстратом и ферментом, образуя комплекс и не образуя продуктов (ферментативная реакция с участием двух и бо­лее субстратов).

Контрольные вопросы

1. Каковы преимущества ферментных препаратов по сравнению с химически­ми катализаторами? 2. Какие ферментные препараты для пищевой промышлен­ности производят в мире в наибольших масштабах? 3. Каковы источники получе­ния ферментов? 4. Как классифицируют ферменты? 5. Какая система названия ферментных препаратов существует в РФ? 6. Каковы характерные черты класса оксидоредуктаз? 7. Каковы характерные черты класса трансфераз? 8. Какие фер­менты относятся к классу гидролаз? 9. Чем отличается класс лиаз от класса лигаз? Каковы особенности действия различных представителей этих классов? 10. Какие реакции катализируют изомеразы? 11. Каковы правила определения активностей ферментных препаратов? 12. Что такое молекулярная активность фермента? 1I. Каковы свойства ферментов? 14. Что такое иммобилизация ферментов? 15. Ка­кие существуют носители для иммобилизации ферментов? 16. Каковы способы иммобилизации ферментов? 17. Как осуществляется каталитическое действие простых и сложных ферментов? 18. Что такое кинетика ферментативной реакции? Как определяются V_max и К_т? 19. Как осуществляются активация и ингибирование ферментов?