РНК-вирусы размножаются в цитоплазме, кроме вирусов гриппа и ретровирусов, которые осуществляют это в ядре. Однако ДHК-поксвирусы репродуцируются в цитоплазме

Репродукция вирусов протекает в несколько стадий (рис. 7).

1. Адсорбция вируса на специфических рецепторах чувствительной клетки благодаря белкам прикрепления (адгезинам) и адресным. У ВИЧ – гликопротеид 120. Примеры клеточных рецепторов: CD4 – молекула для ВИЧ, рецепторы для С3-комплемента – для вируса Эпштейна-Барра, b-адренергические рецепторы – для реовирусов.

2. Проникновение вируса в клетку может идти двумя путями: виропексиса и слияния вирусной и клеточной мембран.

При виропексисе (эндоцитозе) происходит инвагинация участка клеточной мембраны, образование внутриклеточной вакуоли, а далее вакуоль с вирусом может попадать в разные участки цитоплазмы или в ядро клетки.

3. «Раздевание» вирионов или депротеинизация – это процесс освобождения нуклеиновой кислоты вируса от окружающей ее оболочки с последующим проникновением ее в цитоплазму или в ядро клетки. «Раздевание» вириона начинается сразу же после его прикрепления к клеточным рецепторам и продолжается в эндоцитарной вакуоли, а также в ядерных порах и околоядерном пространстве.

4. Биосинтез компонентов вирусов. Нуклеиновая кислота, проникшая в клетку, несет генетическую информацию, которая конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать вирусные белки и нуклеиновые кислоты, которые идут на построение вирусного потомства.

При инфицировании ДНК-содержащим вирусом идет транскрипция ДНК-вируса на иРНК с помощью ДНК-зависимой РНК полимеразы, которая может быть вирусной при репродукции его в цитоплазме или клеточной, если это происходит в ядре (аденовирусы и др.). Причем, если это происходит в цитоплазме (поксвирусы), то вирусная РНК-полимераза считывает часть ДНК-генома и запускает синтез мРНК, а она – образование первичных ферментов для репликации вирусной ДНК. Эти ферменты индуцируют считывание второй части исходной ДНК – появляется «поздняя» мРНК, обеспечивающая синтез структурных белков.

При инфицировании РНК-содержащим вирусом РНК синтезируется с помощью РНК-полимеразы на матрице вирусной РНК; синтез вирусных белков происходит в цитоплазме, а РНК в ядре или в цитоплазме (пикорнавирусы, тогавирусы).

Для (+)РНК-нитевых вирусов (флави-, пикорна-, тогавирусы) функцию информационной РНК выполняет сам геном, который является матрицей для новых молекул РНК, на основе которых в рибосомах синтезируются вирусные белки.

У (-)РНК-вирусов (орто-, парамиксо-, рабдовирусы) геном не выполняет функцию информационной РНК, не обладает инфекционностью, но вирусы имеют РНК-полимеразы, необходимые для синтеза РНК, комлементарных геному, т.е. мРНК, которые обеспечивают синтез вирусных белков.

Иначе осуществляется репликация РНК-содержащих ретровирусов (онкогенные, ВИЧ), в составе которых есть обратная транскриптаза или ревертаза. Уникальность этого фермента состоит в его способности индуцировать синтез цепи вирусной ДНК на матрице вирусной РНК. Этот процесс называется обратной транскрипцией. На матрице одной ДНК-цепи синтезируется комплементарная ей вторая; образовавшаяся 2-нитевая ДНК переносится в ядро. Клеточная ДНК подвергается сплайсингу (под влиянием эндонуклеаз) с образованием рекомбинантов с этой вирусной ДНК. Возникает ДНК-провирус. С помощью клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы интегрированный в ДНК клетки ДНК-провирус считывается с последующим синтезом вирусных (+)РНК и мРНК, которые определяют образование вирусных структурных белков и ферментов. Продолжающийся синтез цепей ДНК обеспечивает новые вирионы геномом.

Для вирусов важен синтез М-белка (матриксный белок), который участвует в сборке вирионов. Сборка нуклеокапсида сложных вирионов начинается на репликативных комплексах и продолжается на плазматической мембране, где присутствуют гликопротеиды суперкапсида. Нуклеокапсиды вируса герпеса и многих ДНК-содержащих вирусов монтируются в ядре клетки на ее мембране. Затем они отпочковываются и приобретают суперкапсидную оболочку. Окончательное формирование вириона осуществляется в мембранах ЭПР и в аппарате Гольджи.

Выход вирусов из клетки происходит:

1) путем взрыва оболочки (клетка при этом погибает), что характерно для вирусов, не имеющих суперкапсида (пикорнавирусы);

2) путем почкования, что присуще вирусам, имеющим суперкапсид (орто-, парамиксо-, рабдовирусы).

Интеграция с клеточным геномом. НК вирусов могут быть включены в геном клетки с помощью эндонуклеаз, рестриктаз и лигаз. Вирусная ДНК в кольцевой форме интегрируется в клеточный геном. Место включения в геном определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями определенных участков. После включения в геном клетки ДНК-вируса становится провирусом, который может изменять клеточный метаболизм, что приводит к возникновению аутоиммунных, хронических заболеваний и опухолей. Под влиянием физических и химических факторов ДНК-провирус вырезается из клеточной хромосомы и становится обычным вирусом. Процесс интеграции РНК-вируса в геном клетки называют вирогенией.

127. Типы вирусной инфекции клеток. Изменения клеток хозяина в процессе вирусной инфекции. Особенности вирусной инфекции организма. Острые, хронические и медленные инфекции.

Вирусы вызывают 2 группы заболеваний: 1) вирусные инф.2) новообразования

Особенности вирусных инфекций:

1. Наиболее широко распространенные (60-80%).

2. Внутрикл. репродукция вирусов приводит к гибели кл.пораженных органов.

3. Некот. вирусы (герпеса, ВИЧ, кори, гепатитов В, С) вызывают инф. ИС и индуцируют развитие вторичных ИД.

4. Интеграция некоторых вирусов с геномом клетки-хозяина (ВИЧ, вирус гепатита В, онкогенные РНК-геномные вирусы) оказывает влияние на экспрессию ее генов.

5. Тератогенные свойства некоторых вирусов (краснухи, цитомегалии).

6. Хронич.вирусные инф. могут индуцировать развитие опухоли (аденовирусы, герпесвирусы, вирусы гепатитов В, С, G).

7. Вирусы могут вызывать медленные инфекции (ВИЧ, вирусы кори, бешенства, гепатита В, герпеса.).

8. Препараты против многих вирусных инфекций отсутствуют.

9. Сложная диагностика.

Типы взаимодействия вирусов с макроорганизмом:

Непродолжительный тип. К этому типу относятся 1. Острая инфекция 2. Инапарантная инфекция (бессимптомная инфекция с непродолжительным пребыванием вируса в организме, о чем мы узнаем по сероконверсии специфических антител в сыворотке.

Длительное пребывание вируса в организме (персистенция).

Латентная инфекция -- характеризуются длительным пребыванием вируса в организме, не соправождающимся симптомами. При этом происходит накопление вирусов. Вирус может персистировать в неполностью собранном виде (в виде субвирусных частиц), поэтому дигностика латентных инфекций очень сложна. Под влиянием внешних воздействий вирус выходит, проявляет себя.

Хроническая инфекция – персистенция проявляется появлением одного или нескольких симптомов заболевания. Патологический процессдлительный, течение сопровождается ремиссиями.

Медленные инфекции. При медленных инфекциях взаимодействие вирусов с организмами имеет ряд особенностей. Несмотря на развитие патологического процесса, инкубационный период очень длительный (от 1 до 10 лет), затем наблюдается летальный исход. Количество медленных инфекций все время возрастает. Сейчас известно более 30.

Возбудители медленных инфекций: к возбудителям медленных инфекций относятся обычные вирусы, ретровирусы, вирусы-сателиты (к ним относят дельта-вирус, который репродуцируется в гепатоцитах), дефектные инфекционные частицы, возникающие естественным или исскуственным мутационным путем, прионы, вироиды, плазмиды (могут быть и у эукариот), транспозоны.

Подострый склерозирущий панэнцефалит. ПСПЭ болеют дети и подростки. Поражается ЦНС происходит медленное разрушение интелекта, двигательные нарушения, всегда летальный исход. В крови обнаруживается высокий уровень АТ к коревому вирусу. В мозговой ткани были обнаружены возбудители кори. Проявляется заболевание сначала в недомогании, утрате памяти, затем появляется расстройства речи, афазия, расстройства письма – аграфия, двоение в глазах, нарушение координации движений - апраксия; затем развиваются гиперкинезы, спастические параличи, больной перестает узнавать предметы. Затем наступает истощение больной впадает в коматозное состояние. При ПСПЭ наблюдаются дегенеративные изменения нейронов, в клетках микроглии -- эозинофильные включения. В патогенезе – происходит прорыв персистирующего вируса кори в ЦНС через ГЭБ. Частота заболеваемости ПСПЭ – 1 на миллион. Диагностика -- с помощью ЭЭГ, определяют также тир противокоревых антител. Профилактика кори одновременно является профилактикой ПСПЭ. У вакцинироваанных против кори заболеваемость ПСПЭ в 20 раз меньше. Лечат ИФ, но без особого успеха.

Врожденная краснуха.

Заболевание характеризуется внутриутробным заражением плода, инфекцируются его органы. Заболевание медленно прогрессирует, приводя к порокам развития и (или) гибели плода.

Для краснухи характерно обызвествление мукопротеидов в системе кровеносных сосудов. Вирус проникает через плаценту. При краснухе часто возникают поражение сердца, глухота, катаракта. Профилактика – прививают 8-9 летних девочек (в США). Применяя убитые и живые вакцины.

Проградиентная форма клещевого энцефалита. Медленная инфекция для которой характерна патология астроцитарной глии. Происходит спонгиозная дегенерация, глиосклероз. Характерно постепенное (проградиентное) нарастание симптомов, что в конце концов приводит к смерти. Возбудитель – вирус клещевого энцефалита, перешедший в персистенцию. Заболевание развивается после клещевого энцефалита или при инфекцировании малыми дозами (в эндемических очагах). Активация вируса происходит под влиянием иммунодепрессантов.

Абортивный тип бешенства. После инкубационного периода развиваются симптомы бешенства, но болезнь не заканчивается летально. Описан 1 случай когда ребенок заболевший бешенством выжил и через 3 месяца даже был выписан из больницы. Вирусы в мозгу не размножились. Были обнаружены антитела.

ЗАБОЛЕВАНИЯ ВЫЗЫВАЕМЫЕ ПРИОНАМИ.

Куру. В переводе Куру обозначает “хохочущая смерть”. Куру является эндемической медленной инфекцией, встречающайся в Новой Гвинее. Куру открыл Гайдушек. Болезнь имеет длительный инкубационный период – в среднем 8.5 лет. Инфекционное начало было найдено в мозгу у людей больных куру. Заболевание проявляется в атаксии, дизартрии, повышенной возбутимости, беспричинном смехе, после чего наступает смерть. Куру характеризуюется губкообразной энцефалопатией, происходит поражение мозжечка, дегенеративное слияние нейронов. Куру обнаружено у племен употреблявших в пищу мозги своих предков без термической обработки. В мозговой ткани обнаруживается 10⁸ прионных частиц.

Болезнь Крейтуфельда-Якоба. Медленная инфекция прионной природы, характеризующаяся деменцией, поражение пирамидных и экстрапирамидных путей. Возбудитель термоустойчив, сохраняется при температуре 70⁰ С. Слабоумие, истончение коры, уменьшение белого вещества головного мозга, наступает смертельный исход. Характерно отсутствие иммунных сдвигов. Болеют пожилые мужчины.

Болезнь Гротнера-Штреуспера. При этой инфекции наблюдаются мозжечковые нарушения, амилоидные бляшки в ткани мозга. Болезнь протекает более длительно, чем болезнь Крейтуфельда-Якоба.

Амиотрофический лейкоспонгиоз. При этой медленной инфекции наблюдается атрофические парезы мышц нижней конечности, затем наступает летальный исход. Встречается заболевание в Белоруссии. Инкубационный период -- продолжается годы. В распространении заболевания имеет место наследственная предрасположенность, возможно пищевые ритуалы. Доказано что распространенное заболевание овец – скрепи тоже вызывается прионами.

Предполагают роль ретровирусов в этиологии рассеянного склероза, вируса гриппа – в этиологии болезни Паркенсона. Вируса герпеса – в развитии атеросклероза. Предпологается прионная природа шизофрении, миопатии у людей. Существует мнение, что вирусы и прионы имеют большое значение в процессе старения, которое происходит при ослаблении иммунитета.

128. Локальные и системные механизмы противовирусного иммунитета. Факторы врождённого и приобретённого противовирусного иммунитета. Контроль репродукции вирусов иммунной системой. Интерфероны: классы, свойства, механизмы противовирусной активности.

Антигенный состав вирусов. В структуре вирусных АГ выявляют области (последовательности АК), распознаваемые рецепторами В-клеток (В-клеточные эпитопы), Т-клеток (Т-клеточные эпитопы) или В-/Т-клеточные эпитопы. АГ активностью обладают и фер-ты, обнаруженные у вирусов (нейраминидаза, полимеразы). Фер-ты кл. происхождения, ассоциированные с вирусом, не являются чужеродными для организма и иммуногенными свойствами не обладают.

Антигены клетки-хозяина, инкорпорированные в вирусных частицах. Уникальной особенностью вирусов, отличающих их от др.живых существ, является их способность инкорпорировать (встраивать) в структуры своих наружных оболочек АГ компоненты кл., в которых они репродуцируются. Примеры таких АГ— рецепторы кл., I и II классы ГКГС.

Вирусиндуцированные АГ. Инфицир.вирусами кл.содержат различные АГ вирусов, которые могут локализоваться в различных кл.структурах — на поверхности кл.мембраны, в ядре, ядрышках, цитоплазме, образуя часто хар-ные включения, видимые в световой микроскоп при окраске или выявляемые методом иммунофлюоресценции. Однако в кл. могут возникать новые АГ, отличающиеся от АГ вируса и от АГ кл. Это «вирусиндуцированные» АГ. Они стимулируют возникновение и развитие КИО и ГИО.

Врожденный противовирусный иммунитет

1. Защита клетки – отсутствие рецепторов.
2. Защита организма. Первый защитный барьер кожа и слизистые. В случае нарушения их целостности в действие вступают КИО и ГИО экстренной неспецифической защиты (врожденного им-та) —ИФ, ЕК, макрофаги, в меньшей степени —СК. Важное значение в резистентности организма к вирусным инф.имеют общефизиологические факторы: t реакция (повыш.t местно и в целом в организме (лихорадка)), местная гипоксия (снижение парциального давления кислорода), ацидоз (усиленное образование кислых продуктов, задержка их выделения) — снижают скорость репродукции вирусов; выделительная реакция (выделение вируса из организма с мокротой, испражнениями, мочой, др.секретами) — способствует восстановлению постоянства внутр. ср. организма, нарушенного инф.

Интерфероны (ИФ) — группа индуцибельных белков гликопротеиновой природы с молекулярной массой от 17 до 80 кД. Синтезируются кл. под влиянием различных индукторов (вирусов, бактерий, простейших, АГ, НК, синтетич.соед.).

3 класса ИФ: ИФ-α — лейкоцитарный, ИФ-β — фибробластный и ИФ-γ — Т-клеточный (иммунный).

Противовирусной активностью обладают ИФ-α и ИФ-β, эффект ИФ проявляется в их способности подавлять внутрикл.репродукцию широкого спектра вирусов.

Помимо противовирусной активности, ИФ обладают противоопухолевым и иммуномодулирующим действием. ИФ стимулируют активность ЕК-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов, повышают чувствительность к ним кл.-мишеней, стимулируют фагоцитоз, антителообразование, активность СК.

ИФ-γ обладает во много раз большей иммуномодулирующей активностью, чем α- и β-. Он стимулирует образование молекул ГКГС класса II, является кофактором дифференцировки и активации В-лимф. и антагонистом действия на них ИЛ-4, влияет на процессы биосинтеза Ig, стимулирует ЕК, активирует макрофаги.

Вирусные ингибиторы — вирусотропные в-ва, вырабатываемые организмом, способные взаимодействовать непосредственно с вирусами и подавлять их активность. Эти в-ва обнаружены в сыворотке кр., тканях, биосекретах. Описаны термолабильные β-ингибиторы (утрачивающие активность при 60-62°С), умеренно термостабильные α-ингибиторы (инактивирующиеся при 75°С) и γ-ингибиторы (устойчивые к нагреванию до 100°С). Механизм действия ингибиторов сходен с действием АТ. Они блокируют рецепторы. В результате вирус утрачивает способность фиксироваться на поверхности чувствительной кл. и, соответственно, утрачивает инфекционность.

ЕК— тип лимф., не имеющих маркеров Т- и В-клеток и АГраспознающих рецепторов. Распознают инфицир. вирусом кл.неспецифически. В гранулах цитоплазмы содержат перфорин и сериновые протеазы — гранзимы.

Роль макрофагов заключается как в самом фагоцитозе (поглощении и биодеградации вирусов), так и в переработке и представлении антигена Т-лимф. при участии ГКГС класса II.

Белки СК в противовирусной защите играют менее значимую роль по сравнению с др. факторами. Ряд компонентов (С1, С2, С4) нейтрализует или ингибирует некот. вирусы. СК повышает вируснейтрализующую функцию АТ (IgM), совместно с ними вызывает лизис вирусов, содержащих гликолипидные в-ва в структурах наружных оболочек, принимает участие в цитолизе инф. вирусами кл. Б.опред. вирусов способны активировать комплемент по альтернативному пути.

3. Приобретенный (адаптивный, АГспециф.) противовирусный иммунитет.

Цитотоксические Т-лимф. CD8⁺ — основная субпопуляция Т-системы лимф., осуществляющая эффекторные мех-мы противовирусного иммун. надзора; распознают вирусные АГв комплексе ГКГС класса I на мембране кл.-мишеней.

Эффекторные и регуляторные CD4⁺-лимф. распознают эпитопы АГ вирусов, процессированные в АПК кл.в комплексе с ГКГС II класса. Они подразделяются на CD4⁺ Тх 1-го и 2-готипов.

Гуморальный иммунный ответ. ГИО реализуется В- лимф. при участии регуляторных механизмов Т-.кл. иммунитета. Белки и пептиды вирусов являются Т-зависимыми АГ. В лимфоидной ткани слизистых образуются преимущественно IgA. Они накапливаются в секретах слизистых и предотвращают повторную инфекцию.

Часто, особенно при острой продуктивной форме вирусной инф., больной выздоравливает раньше, чем в его кр.появляются АТ в достаточном титре. Выздоровление наступает за счет активного действия систем Т-киллеров и ИФ, но они не формируют приобретенного специф.им-та. Его возникновение происходит в связи с синтезом специф.АТ. Активированные Тх синтезируют факторы активации, пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. В результате образуются клоны плазмоцитов и клоны кл. памяти. При сохранении достаточного уровня клонов В-клеток памяти приобретенный гуморальный противовирусный иммунитет может быть пожизненным.

Механизмы ускользания вирусов от защитных факторов организма

1. АГ изменчивость (ВИЧ, вирусов гриппа, ящура).

2. Подавление синтеза кл.б-ков.

3. Блокирование действия ИФ(вирус Эпштейна-Барр, аденовирусы).

4. Поражение иммунокомпетентных кл. (В- и Т-лимф., АПК), нарушение их функции (ВИЧ, герпесвирусы) и в конечном итоге развитие ИДС.

5. Стимуляция иммунокомпетентных кл.к продукции иммуносупрессивных факторов.

6. Ингибиция биосинтеза наиболее важных цитокинов (ретровирусы, вирус Эпштейна-Барр).

7. Индукция аутоиммунных и аллергических процессов (вирусы гепатита В, герпеса, цитомегалии, Эпштейна-Барр, аденовирусы,)

8. Ингибиция активации СК.

Ускользание вируса от защитных факторов приводит к его персистенции в кл. и создает возможность для формирования латентной инф.

129. Принципы этиологической диагностики вирусных инфекций. Экспресс-методы.

Серологический метод диагностики: принципы проведения, критерии постановки диагноза. Реакция торможения гемагглютинации/гемадсорбции: механизмы, способы постановки, учёт, применение. Реакция нейтрализации: механизмы, способы постановки, учёт, применение.

В основе лабораторной диагностики вирусных инфекций лежат 4 группы методов:

1 группа – обнаружение возбудителя или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного, и получение ответа через несколько часов (быстрая; экспресс-диагностика). Электронная микроскопия.

2 группа — выделение вируса из клинического материала, его индикация и идентификация (вирусологическая диагностика).В большинстве случаев конц. вируса в материале недостаточна. В этих случаях используют вирусологическую диагностику. Эта группа методов требует продолжительного времени, трудоемка, часто является ретроспективной. Однако она является необходимой для инф., вызванных новыми типами вируса, или когда невозможно провести диагностику др.методами.

Индикация вирусов в культуре кл. проводится по ЦПД, РИФ, РГА, РГАдс. Идентификация вирусов проводится с помощью серологических методов (РТГА - ингибирование специфическими Ат феномена гемагглютинации (склеивания эритроцитов гемагглютининами вируса), РН, РТГАдс, используются только при вирусных инфекциях. РСК, РПГА, ИФА, РИА, ИФ, РП используются для диагностики как вирусных инф., так и инф, вызванных другими возбудителями).

3 группа — серологическая диагностика вирусных инфекций. В большинстве случаев для серологической диагностики требуются парные сыворотки, взятые в острой фазе заболевания и спустя 2-4 недели. Обнаружение четырехкратного и более повышения титра антител принято рассматривать в качестве диагностического признака острой вирусной инфекции.

4 группа — молекулярно-биологические методы индикации, идентификации и клонирования вирусов. Проводятся с целью выявления вирусспецифических фрагментов генома вирусов в материале.

Молекулярно-биологическая индикация вирусов в биологическом материале:

– Методы молекулярной гибридизации (метод микрогенов). Проводятся с целью выявления вирусспецифических фрагментов генома вируса. Хар-ся высокой чувствительностью и специфичностью. Используются для выявления цитомегаловирусов, вирусов герпеса, вирусов гепатита.

– Полимеразная цепная реакция (ПЦР): проведение индикации вирусов, идентификации, дифференциации с родственными инф.агентами, генотипирование изолятов вирусов и клонирование фрагментов их генома.

– Вестерн-блоттинг — основан на выявлении циркулирующих в крови специфических АТ к АГ вируса.

130. Культивирование вирусов. Культуры клеток: виды, методы заражения. Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток. Типы ЦПД. Вирусные включения: природа, локализация, значение.

Метод культур клеток. Для приготовления культур клеток используют различные ткани человека и животных. Чаще применяют культуры клеток из эмбриональных (куриные фибробласты, человеческие фибробласты) и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих активной способностью к росту и размножению.

Различают три типа культур клеток: однослойные культуры клеток; культуры суспензированных клеток; органные культуры.

Однослойные культуры клеток по числу жизнеспособных генераций разделяют на первичные или первично трипсинизированные (куриные фибробласты, человеческие фибробласты); перевиваемые (способны размножаться в лабораторных условиях длительное время); полуперевиваемые (способны размножаться в течение 40-50 пассажей).

Первичные (неперевиваемые) культуры кл.— это кл. какой-либо ткани, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в спец. питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен. Их получают из ткани после механич. измельчения, обработки протеолитическими ф-тами и стандартизации кол-ва кл.

Полуперевиваемые (диплоидные)— кл.одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона ч-ка используются для диагностики вирусных инф. и при пр-стве вирусных вакцин.

Перевиваемые кл.линии х-ся бессмертием и гетероплоидным кариотипом. Источником перевиваемых линий могут быть первичные кл.культуры (СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи), отдельные кл. которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в кл. таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Др. источник перевиваемых кл. линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация кл. происходит in vivo. Применяются следующие линии перевиваемых кл.: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки..

Трансфецированные культуры кл. Разработаны экспериментальные линии культур кл. методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных АГ. Такие культуры кл. экспрессируют поверхностный б.опред. вируса (HBs-антиген, gp120) на мембране. Такие культуры используются для изучения иммунологических мех-мов патогенеза вирусных инф., разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред – наличие 5-10 % сыворотки крови животных (телячьей, бычей, лошадиной), без наличия которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Культуры суспензированных клеток растут и размножаются во взвешенном состоянии при постоянном интенсивном перемешивании среды. Они используются для накопления вирусов.

Некоторые вирусы размножаются в органных культурах – это кусочки органов, выращенные вне организма и сохраняющие структуру данного органа.

Биологический метод. Заражение.

При выделении вирусов из различных инф. материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые, смывы из органов) применяют культуры кл, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры с хорошо развитым монослоем кл. Перед заражением питат. среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного а\б для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с монослоем кл.удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

О размножении вируса в культуре клеток судят по следующим признакам: цитопатогенному действию (ЦПД); образованию в клетках включений; появлению бляшек; феномену гемадсорбции; цветной пробе.

Цитопатогенное действие может проявляться полной дегенерацией клеток – слущиванием клеток с поверхности стекла после их гибели (энтеровирусы полиомиелита, Коксаки); частичной дегенерацией – округлением клеток, слиянием и образованием симпластов (вирус кори).

Образование включений в клетках – это скопление вирионов или отдельных компонентов в цитоплазме или в ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца гварниери, вирусы герпеса, аденовирусы – внутриядерные включения.

Появление бляшек – зоны клеток, разрушенных вирусом (негативные колонии вирусов), обнаруживают в клеточных культурах, растущих на стекле и покрытых тонким слоем агара. Бляшки различаются по величине, форме, времени появления, поэтому данный тест используют для дифференциации вирусов.

Реакция гемадсорбции заключается в способности клеток, зараженных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, потому что эти клетки несут на поверхности гемагглютинины вируса.

Цветная реакция основана на изменении цвета питательной среды с индикатором, используемой для культур клеток. При росте клеток, не пораженных вирусом, идет накопление продуктов метоболизма, которые изменяют цвет питательной среды. При репродукции вирусов в культуре нарушается метаболизм клеток, и среда сохраняет первоначальный цвет.

131. Культивирование вирусов в курином эмбрионе: методы заражения, индикации и идентификации вирусов. Культивирование вирусов на лабораторных животных: методы заражения, индикации и идентификации вирусов.

Выделение вирусов в куриных эмбрионах

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7- 12-дневного возраста. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона путем овоскопирования. Живые эмбрионы проявляют двигательную активность, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом очерчивают границы воздушной камеры. Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения могут быть различны: нанесение материала на хорион-аллантоисную оболочку, введение в амниотическую и аллантоисную полости или в желточный мешок. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной РГА на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию «бляшек» на хорион-аллантоисной оболочке.

Выделение вирусов на лабораторных животных

Лабораторные животные используются для выделения вирусов из инф. материала, когда невозможно применить культуры кл. или куриные эмбрионы. Используют преимущественно новорожденных белых мышей, сирийских хомяков. Заражают животных в соответствии с цитотропизмом вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на проявлении у животных признаков инфекционного заболевания, их гибели, характере патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглютинации.

132. Принципы химиотерапии вирусных инфекций. Группы противовирусных препаратов. Вирусная нагрузка, методы её определения.

Химиотерапия и химиопроф-ка вирусных инф. отличается от химиотерапии бактер. инф. Вирусы — внутрикл. паразиты, на которые не действуют АБ. Мишенью действия антивирусных пр-тов являются ключевые этапы взаимодействия вируса с кл. — процессы адсорбции, проникновения вируса в кл., процессы депротеинизации, синтетическая фаза вирусной репродукции (транскрипция, трансляция и репликация), сборка, созревание и выход вируса из кл.

1 группа — аномальные нуклеозиды — аналоги предшественников нуклеинового обмена, ингибируют функции вирусных полимераз или включаются в цепочку НК, делают ее нефункциональной.

Аналог пиримидина — йоддезоксиуридин, применяется для лечения герпетических кератитов, кожного герпеса и цитомегалии. Пуриновые аналоги — видорабид, применяют для лечения герпетических энцефалитов, ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Ацикловир (зовиракс) — используют также для лечения разных видов герпетической инфекции. Рибовирин — эффективен против РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Для лечения ВИЧ-инфекции получены нуклеозидные аналоги, ингибирующие обратную транскриптазу— азидотимидин, тимазид, хивид.

2 группа — производные адамантанамина гидрохлорида. Препараты: амантадин и ремантадин, ингибируют репродукцию вирусов гриппа, кори, краснухи. Механизм действия — нарушение депротеинизации вируса.

3 группа — тиосемикарбазоны. Препарат метисазон (марборан), активен против вирусов натуральной оспы. Механизм действия в подавлении синтеза вирусных белков.

4 группа — ингибиторы протеаз вирусов. Сущность противовирусного эффекта в том, что многие б.пикорна-, орто-, адено-, тога-, ретровирусов формируются из крупных молекул-предшественников и лишь после разрезания этих б.на фрагменты протеазами. Гордокс, контрикал.

5 группа — препараты типа «нуклеаз», способных повреждать геном вирусов, что даст возможность лечить интеграционные вирусные болезни.

6 группа — интерфероны. В настоящее время используется a-ИФ для лечения и для проф-ки, особенно респираторных вирусных инф. Механизм действия — нарушение синтеза вирусных б.

7 группа — иммуноглобулины (Ig) вирусспецифические, которые получают из крови реконвалесцентов или специально вакцинированных доноров. Используются для профилактики кори, гепатитов А, В, гриппа, парагриппа и других вирусных инф. (для проф-ки бешенства используется антирабический Ig, полученный из крови иммунизированных животных).

8 группа — вакцины: убитые вакцины, содержащие инактивированные формалином или b-пропиолактоном вирусы (вакцина против гриппа, кори, полиомиелита, японского и клещевого энцефалитов, бешенства); живые (аттенуированные) вирусные вакцины, содержащие вирусы с ослабленной вирулентностью (вакцина против гриппа, кори, эпидемического паротита, краснухи, полиомиелита, бешенства, желтой лихорадки и др.); субъединичные вакцины, содержащие вирусные протективные АГ(субъединицы) (вакцина против гриппа); рекомбинантные (генно-инженерные) вакцины (вакцина против гепатита В, для получения которой ген, кодирующий НВs-антиген, внедрен в геном дрожжевой клетки).

149. Бактериальные вирусы (фаги): свойства, классификация. Взаимодействие вирулентных и умеренных фагов с восприимчивой бактерией. Умеренные фаги. Лизогения. Практическое использование бактериофагов: фаготипирование, фагопрофилактика, фаготерапия.

Бактериофаги (от бактерий и греч, рhagos -пожиратель) – вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их лизис. Они не размножаются в эукариотических клетках.

Морфология. Большинство фагов под электронным микроскопом напоминают по форме головастика или сперматозоида; имеют головку и отросток (рис. 8), но встречаются и другие морфологические варианты. Размеры фагов – 20-200 нм. Выделяют пять основных типов бактериофагов.

Структура. Фаги имеют ДНК или РНК и белок. Двунитевая ДНК фагов замкнута в кольцо и упакована в головке. Некоторые фаги содержат однонитевую ДНК или РНК. Капсид головки фага образован белками по кубическому типу симметрии.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действую физических и химических факторов, чем бактерии и вирусы. Они выдерживают давление до 6 000 атм, сохраняют свою активность при рН от 2,5 до 8; не все дезинфицирующие вещества (0,5% раствор фенола, 1% раствора сулемы, этиловый спирт, эфир, хлороформ) разрушают фаги. Однако УФИ и ИИ, 1% раствор формалина убивают их. Они сохраняются длительное время при высушивании, замораживании, в глицерине.

Антигенные свойства. Бактериофаги обладают иммуногенными свойствами, вызывают синтез антител (AT), которые не дают перекрестных реакций с антигенами (АГ) бактерий, инфицированных фагами. Для идентификации фагов применяют реакцию нейтрализации с гомологичной антисывороткой, реакцию преципитации, реакцию агглютинации. По антигенам фаги делятся на серотипы.

Взаимодействие фагов с бактерией включает несколько стадий.

Адсорбция фагов на бактерии осуществляется рецепторами фага, имеющимися на конце отростка, которые связываются с поверхностными структурами бактериальной стенки. Бактериофаги не адсорбируются на бактериях, лишенных клеточной стенки (протопластах). Некоторые фаги адсорбируются на F-пилях бактерий. Адсорбция фагов зависит от рН среды, температуры, наличия некоторых веществ (триптофана для Т2-фага). На одной клетке может адсорбироваться до 300 фагов.

Внедрение нуклеиновой кислоты фага (инъекция фага). Базальная пластина отростка и его лизоцим лизируют участок клеточной стенки бактерии. Одновременно в чехле высвобождаются ионы кальция, активирующие АТФ-азу, происходит сокращение чехла и вталкивание стержня отростка через мембрану в бактерию. При этом фаговая ДНК (РНК) через стержень впрыскивается в цитоплазму клетки, белки головки и отростка остаются снаружи.

Репродукция фага. Проникнув в клетку ДНК фага переходит в латентное состояние (скрытая – эклипс-фаза). В этот период она подавляет синтетические клеточные процессы клетки и индуцирует синтез фаговых белков.

Синтез фаговых белков. Бактериальная РНК-полимераза транскрибирует фаговую ДНК в мРНК, по которой в рибосомах синтезируются ранние белки фага и его РНК-полимераза. Последняя обеспечивает транскрипцию поздних белков оболочки..

Репликацию фаговой нуклеиновой кислоты осуществляют синтезированные в клетке ДНК-полимеразы. ДНКбактерии нередко расщепляется и служит материалом для синтеза нуклеиновой кислоты фага.

Сборка фаговых частиц заключается в заполнении фаговой ДНК пустотелых капсид головки. Весь процесс осуществляется за 40 минут. Выход зрелых фагов обычно происходит путем лизиса бактериальной клетки. Лизис чаще всего осуществляется фаговым лизоцимом. Фаги, лизировавшие бактерии, называют вирулентными и они могут находиться в двух состояниях: 1) в виде зрелого фага – метаболически инертного, существующего вне клетки, и 2) вегетативного, который размножается в клетке и вызывает «продуктивную» инфекцию у бактерий. Некоторые ДНК-содержащие фаги (фаг fd) выходят из клетки путем «просачивания» ДНК через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку бактерии, где упаковываются в капсиды.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуются высокой специфичностью. Моновалентные фаги взаимодействуют только с бактериями определенного вида, а типовые фаги – только с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий. Типоспецифические бактериофаги используют для выявления соответствующих бактерий – т.е. для их фаготипирования. Поливалентные фаги могут взаимодействовать с родственными видами бактерий.

Умеренные фаги и лизогения. Взаимодействие фага с клеткой иногда ведет к интеграции его генома в геном бактерии. Фаги, вызывающие данный тип взаимодействия, называют умеренными. ДНК умеренного фага встраивается в ДНК бактерии и такой фаг называют профагом. Таким образом, умеренные фаги бывают в трех состояниях: зрелый фаг, вегетативный фаг и профаг. Профаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении реплицируется синхронно с ее геномом, но не вызывает бактериолизиса, а передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

Явление интеграции генома бактерии с умеренным фагом в состоянии профага называется лизогенией, а бактерии, несущие профаг – лизогенными. Бактериальная клетка, несущая в себе профаг, становится резистентной к действию идентичного фага. В клетке вырабатываются репрессоры – белки генома профага, препятствующие его размножению и проникновению в клетку идентичных фагов. Связь генома профага и бактерии непостоянна и под действием УФИ, радиации, некоторых химических веществ возможно образование зрелых форм фага и лизис бактерии. Эти фаги, бывшие профагами, могут со своей ДНК переносить группы генов бактерии в другую бактерию, в которой они снова переходят в профаг. Изменение свойств МО под влиянием профага обозначается как фаговая лизогенная конверсия. Явление переноса генов бактерий умеренными фагами называют трансдукцией. Эти фаги обычно неспособны образовывать фаговое потомство, если в их нуклеиновую кислоту встроилась часть нуклеиновой кислоты бактериальной клетки. Трансдуцирующие фаги используют в качестве векторов (переносчиков) в генной инженерии.

Практическое использование фагов.

Фаготипирование: проводят идентификацию выделенных культур МО – устанавливают с помощью фага принадлежность неизвестной выделенной культуры бактерии к определенному виду или типу. Имеет большое эпидемиологическое значение, так как позволяет установить источник и пути распространения инфекций.

Фагодиагностика: например, если не смогли выделить возбудителя при подозрении на дизентерию (т.к. они размножаются в энтероцитах). Зато можем обнаружить дизентерийный бактериофаг, что будет указывать на присутствие возбудителя.

Фаготерапия и профилактика. Налажено производство брюшнотифозного, сальмонеллезного, дизентерийного, протейного, синегнойного, стафилококкового, стрептококкового, коли-фагов и комбинированных фагов. Фаги выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в форме мазей, аэрозолей, свечей.

133. Этиология острых респираторных вирусных инфекций. Вирусы гриппа: классификация, характеристика. Грипп: патогенез, иммунитет, профилактика. Риновирусы: классификация, характеристика, роль в патологии.

Этиология ОРВИ человека:

1. Вирусы гриппа А, В, С
2. Вирусы парагриппа и РС-вирус
3. Реовирусы
4. Риновирусы
5. Энтеровирусы (ЭКХО и Коксаки)
6. Коронавирусы
7. Аденовирусы

Семейство ортомиксовирусов (Оrthomyxoviridae). К семейству ортомиксовирусов (греч. orthos – правильный, myxa – слизь) относятся вирусы гриппа родов Influenzavirus А, В, С.

- Имеют тропизм к эпителию слизистых оболочек дыхательных путей.

- Вирусы гриппа рода А патогенны для человека и некоторых животных (лошади, свиньи), а также для птиц. Пандемии и эпидемии

- Вирусы родов В (эпидемии) и С (стабилен) поражают только людей.

- Агглютинируют широкий круг эритроцитов человека, животных и птиц.

- Клеточные рецепторы для вирусов имеют мукопротеидную природу.