Тест дегрануляции базофилов

У больных аллергией значительная часть IgE связывается различными лейкоцитами через их Fc-рецепторы. Наличие клеток, несущих антитела, указывает на сенсибилизацию их к соответствующему аллергену. Базофилы крови и тучные клетки являются первичными эффекторными клетками в IgE-опосредованных аллергических реакциях немедленного типа, таких, как аллергический ринит, бронхиальная астма, крапивница и анафилактический шок. В острый период количество базофилов, нагруженных иммуноглобулинами, в крови снижается за счет перехода их в ткани, и обнаружить их труднее. Чаще они выявляются в период ремиссии.

Тесты, основанные на реакции базофилов в присутствии аллергена, основаны на прямом микроскопическом исследовании базофилов при специальном окрашивании клеток. При наличии сенсибилизации в присутствии специфического аллергена происходит повреждение (дегрануляция) базофилов больных. Морфологическими критериями дегрануляции являются активное движение гранул, окрашенных нейтральным красным или толуидиновым синим, внутри клетки; подвижность базофилов, нарушение формы клетки, выход гранул за пределы клетки и ее обесцвечивание.

Вариант 1. Для постановки реакции используют кровь, стабилизированную гепарином (10-15 мл). Отстаивают 30-40 минут. Плазму с лейкоцитами отбирают и центрифугируют 3-5 минут при 500 об/мин. Из полученного осадка лейкоцитов, обогащенного базофилами, без отмывания (во избежание дегрануляции) готовят суспензию клеток на забуференном физрастворе (5*10⁶ клеток в 1 мл). На сухое предметное стекло, предварительно покрытое 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного (раствор красителя готовят, инкубируя его при 37 °С в течение суток), нанесят по 50 мкл лейкоцитарной суспензии и раствора аллергенa в нужной концентрации Раствор аллергена не должен вызывать дегрануляцию несенсибилизированных лейкоцитов. Его оптимальная концентрация предварительно подбирается. Для пыльцевых и бактериальных аллергенов она составляет от 10 до 100 PNU/мл, для антибиотиков 100-1000 Ед/мл, 0,01-0,1% для растворов химических аллергенов. Приготовленный препарат накрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелином. Аналогично готовятся контрольные пробы, куда вместо аллергена добавляют буферный раствор. После инкубации при 37°С
15 мин при микроскопии под иммерсией подсчитывают не менее 40 базофилов и определяют процентдегранулированных клеток. Реакция считается положительной, если в опытена 15% и более поврежденных клеток больше, чем в контроле.

Вариант 2. В лунки планшета вносят 50 мкл суспензии лейкоцитов, приготовленной на забуференном физрастворе из гепаринизированной крови и добавляют равный объем оттитрованного аллергена. В контрольной лунке вместо аллергена используется буферный раствор. Инкубируют лунки при 37°С 15 минут, после чего в каждую из них добавляют по 100 мкл 0,025%-ного раствора толуидинoвого синего (750 мг на 1 л 25%-ного раствора этанола, рН 3,5 доводят добавлением ледяной уксусной кислоты) и подсчитывают число окрашенных базофилов. Толуидиновый синий окрашивает гранулы базофилов. В контроле должно содержаться не менее 30 базофилов. Подсчет клеток проводят в камере Горяева. Можно использовать несколько камер, чтобы общее количество базофилов отвечало указанному условию. Реакция считается положительной, если число окрашенных клеток в опыте уменьшилось на 30% и более.

Тест дегрануляции базофилов в клинической практике не получил широкого распространения в связи с трудностью его постановки при небольшой концентрации клеток, обычно присутствующих в крови. По сравнению с микроскопическими методиками более прогрессивными являются цитометрические исследования.