Методы разделения фрагментов ДНК. Электрофорез в агарозных и полиакриламидных гелях

фракционирование молекул ДНК или РНК по размеру в гелевом носителе под действием электрического поля

Носители - агароза или полиакриламид (ПААГ)

Акриламид СН2=СН-СОNН2

Агароза - фракция природного линейного полисахарида агара (b-D-галактопираноза и ангидро-a-L-галактопираноза

э/ф стандартный метод, который используется для разделения и индификации фрагментов ДНК. С помошью его можно быстро разделить смесьна фрагменты. При этом прямо наблядать за положением ДНК, т.к полосы ДНК в геле,окращ-ся флуорисц и интеркарирующим (т. е. Вставляющимся) между основными красителя, которыминазыв БРОМИСТЫЙ ЭТИДИЙ. (При наличие его сниж есть ДНК) Скорость миграциии ДНК в геле зависит от: 1. Молек массы 2. сопротивления (концентрация геля(агарозы))обратно пропорц. 3. Мощность (прилож напряжения) от напряж эл поля. 4. Конформации ДНК(2х цепоч,1 цепочечн,кольцевая). 5. от темп (полиакриламидн(ПАА)) и состава основания. Приспособления для проведения Э/Ф: - Камера или кувета(в котором размещен гель) гельнад самой поверхностью буфера в горизон Э/Ф. - Сопротивление геля к электр-му току мало отл от сопротивления буфера,поэтому по гелю проходит значительная часть тока. - необходим буфер: 1. ТБЕ-трисбаратный более высокая буферная емкость исполь для вертик=ПАА 2. ТАЕ-трисацетатный для гориз=агарозного. Концентр буфера=50м моль,рН=7,5-7,8 -Агароза(ПАА)-порошок из ламинария(водорослей) при приготовлении навеска заливают буфером той же концентрациии - вставлюят гребенку (образование лунок) после полимеризации (20-30мин) гребенку удаляют. Заливают буфер в лунки наносят пробы ДНК(аплификаты) Пробф ДНК: нужное количество ДНК и плюс краску либо бронфиноновый синий(БФС),либоксинонцианол (чтобы утяжелить) достаточное количество ДНК 2 нанограмма. К камере подключают напряжение от 80-150В. Разгонка до часу(20-60мин) и просматривают в УФ светефотографируют и генетипируют образцы. Секренирование- определение последовательности НК. Вертикальный Э/Ф (В ПАА) используют для разделение фрагментов отлич-ся на 1-2 полинуклеотидов и более(более точный). Концентр ПАА=3,5-30% от размера фрагмента гель заливают между 2 стекл пластинками разделен-ми спейсерами от 0,8-4мм. Протек при высоком напряжении =1000В. Красят после Э/Ф и визуализируют под УФ. ПАА очень токсичен(работа в перчатках) бромистый этидий- канцероген.

52. ДНК-диагностика моногенных болезней*

В данном разделе будут рассмотрены вопросы ДНК-диагностики только моногенных наследственных болезней. ДНК- диагностика мультифакториальных заболеваний также активно разрабатывается, особенно в последние годы, но обычно она может быть эффективной лишь при тех патологических состояниях, для которых удается вычленить "главный" ген, мутации которого приводят к болезни; в этих случаях стратегия диагностики мультифакториальной патологии сходна с ДНК- исследованиями при моногенных болезнях.

Все разнообразие применяемых в настоящее время в молекулярной генетике подходов для идентификации определенных генов или определенных фрагментов ДНК и их вариаций основывается на двух основных методологических разработ-ках - технологиях блот-гибридизации и амплификации отдельных участков ДНК.

Методология блот-гибридизации используется уже более 20 лет без принципиальных модификаций. Принцип блот-гибридизации ДНК по Саузерну показан на рис. 13. Анализ начинается с выделения ДНК из любой ядросодер- жащей ткани организма (из любого органа, ткани, культивируемых клеток). Обычно у обследуемого берется несколько мил-лилитров крови, а при пренатальной диагностике - амниоти- ческая жидкость или биоптат хориона. Выделенная клеточная ДНК обрабатывается одной из рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющей ДНК в строго определенных сайтах. В результате получается характерный для данного человека набор из огромного множества фрагментов различной длины, которые при электрофоретическом фракционировании в агарозном или полиакриламидном геле располагаются в зависимости от их • молекулярного веса: чем меньше фрагмент, тем выше скорость его миграции в геле. На следующей стадии происходит сам Саузерн-блоттинг (названный по имени доктора из Эдинбурга Эдмунда Саузерна, предложившего метод, а английское blot - означает промокать): фрагмент ДНК переносится осмотическим током жидкости из влажного геля на помещенный на него нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр. На фильтре получается реплика ДНК-рестрикта. При переносе в щелочной среде ДНК денатурирует, то есть переводится в одноцепочечное состояние, в котором она может гибридизо- ваться с меченым ДНК-зондом на исследуемый ген или ДНК- фрагмент. В зависимости от способа мечения (радиоактивный или флуоресцентный) гибридные фрагменты, соответствующие изучаемой ДНК-последовательности, выявляются авто- радиографически или с помощью флуоресцентной метки.

Методология амплификации дает возможность оперировать с существенно меньшими количествами ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет проводить селективную амплификацию отдельных регионов ДНК посредством имитации in vitro репликации ДНК. Для реакции необходимы олигонук- леотидные праймеры, комплиментарные фланкирующим последовательностям анализируемого участка ДНК.

ДНК-цепь, комплиментарная взятой для исследования матрице (одноцепочечной исследуемой ДНК), синтезируется при участии фермента Taq-ДНК-полимеразы, начиная со свободного -3'- конца праймера. Для проведения ПЦР (рис. 14) в реакционной смеси необходимо наличие анализируемой ДНК, всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ДНК-полимеразы, двух олигонуклеотид- ных праймеров - прямого (F-forward) и обратного (R - reverse).

Одноцепочечная ДНК-матрица легко образуется при тепловой денатурации двойной цепи ДНК. Олигонуклеотидные праймеры можно либо синтезировать в лаборатории, либо приобрести. Обычно используемые для ПЦР реакционные буферы содержат ионы Mg²⁺, моновалентные катионы и некоторые добавки. Добавки могут помогать стабилизировать фермент, влиять на кинетику процесса и/или температуру плавления ДНК (Т_т). Большинство используемых ДНК-полимераз яв-ляются термостабильными и могут выдерживать нагревание до 95° - 97° С.

Как правило, ПЦР требует три температурных режима: 1) при 90-95° С осуществляется температурная денатурация двойной нити ДНК на две комплиментарные цепи; 2) при 50-65° С происходит отжиг праймеров (их гибридизация) на специфичных праймерам последовательностях матрицы; 3) обычно при 72° С протекает ферментативный синтез цепи ДНК, то есть праймер достраивается, начиная с 3'-конца, присоединением dNTP. Последовательные денатурация, отжиг и синтез с определенным фиксированным временем каждого этапа называется циклом. Повторение таких циклов ведет к множественной амплификации ДНК. Специфичность ПЦР обеспечивается в первую очередь праймерами, которые синтезируются химическими методами и обычно имеют длину 20-30 нуклеотидов. Подбор эффективных праймеров для ПЦР - процесс эмпирический, но соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения праймеров пригодных для использования:

Выбирают праймеры с содержанием GC>>50 % и случайным распределением оснований. Следует избегать прай-> меров с протяженными полипуриновыми или полипиримиди- новыми последовательностями.

Избегают последовательностей с устойчивой вторичной структурой.

Проверяют затравки на комплиментарность друг другу. Праймеры? отжигающиеся друг с другом, не смогут участвовать в амплификации (Анализ генома, 1990).

Праймеры ориентированы таким образом, чтобы синтез протекал только между ними (см. рис. 14), удваивая количество копий этого участка ДНК. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов амплификации, они детерминируют сам продукт реакции - фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5'-концами праймеров на исследуемом участке ДНК. В результате циклического повторения стадий ПЦР происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента по формуле: (2^П- 2п), где п - количество прошедших циклов амплификации.

Для постановки ПЦР используют специальные приборы - ДНК-амплификаторы или термоциклеры, позволяющие программировать и поддерживать необходимый температурный цикл, обеспечивающий оптимальное прохождение каждой стадии реакции.

ПЦР позволяет в течение нескольких часов выделить и размножить определенный фрагмент ДНК в количестве, превышающем исходное примерно в 10⁹ раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает работу с минимальными количествами ДНК-образцов. Реакция высоко специфична и очень чувствительна, позволяет исследовать даже единичную копию гена в исходном материале.

Для идентификации мутаций разработаны подходы, приведенные в таблице 12. Говоря о подходах к ДНК-диагностике наследственных болезней, прежде всего, различают прямую и непрямую молекулярную диагностику генных болезней.

В случае прямой диагностики объектом исследования являются мутации определенного гена, идентификация которых - главная задача анализа. Данный вариант диагностики наиболее точен, но для его осуществления необходима информация о локализации, природе и частоте наиболее частых (ма-жорных) мутаций гена или данные о наличии в гене "горячих точек" или районов преимущественного мутирования. К преимуществам прямых методов, кроме практически стопроцентной точности диагностики у обследуемого, относится отсутствие необходимости обследования других родственников пробанда.

Прямая диагностика эффективно применяется пока только для сравнительно небольшого числа наиболее распространенных наследственных заболеваний, в том числе: муковис- цидоз, недостаточность а₁-антитрипсина, фенилкетонурия, миодистрофия Дюшенна, гемофилии А и В, недостаточность 21-гидроксилазы, талассемии, нейрофиброматоз, синдром ломкой Х-хромосомы и некоторые другие, молекулярная природа которых уже хорошо изучена.

53.детекция престроек ДНК на примере Дюшенна.

Гибридизационную детекцию крупных ДНК-перестроек (де- леций или дупликаций) продемонстрируем на примере мышечной дистрофии Дюшенна – МДД(Наследственное нервно-мышечное заболевание, характеризующееся прогрессирующими дегенеративными изменениями в поперечнополосатой мускулатуре.

Молекулярный механизм патогенеза. Нарушение синтеза дистрофина – белка, отвечающего за целостность мембраны в сарколемме. Структурные изменения сарколеммы. Дегенерация цитоплазматических компонентов. Гибель миофибрилл

Клиника. Миодистрфия Дюшенна (МД). Прогрессирующая атрофия мышечных волокон, в том числе кардиомиопатия. Первичные проявления до 2-х лет. Выраженная картина к 2-3 летнему возрасту. Летальный исход на 2-3 десятилетии жизни

Миодистрофия Беккера (МБ). Доброкачественная форма МД с более мягкими симптомами. Начало болезни в 10-15 лет. Работоспособность в возрасте 20-30 лет. Фертильность. Нет кардиомиопатий.

Наследование. Х-сцепленное рецессивное

Частота. МД ~ 1:3000 (новорожденные м.). МБ ~ 1:20000

Молекулярная генетика. Структурные нарушения гена дистрофина. (2 млн п.н., >60 экзонов).

Наиболее частые мутации – средние и крупные делеции, приводящие к полному прекращению синтеза белка (МД) или небольшие делеции и точечные мутации, снижающие уровень синтеза белка, либо синтез аномального дистрофина (МБ).

До 30% мутаций – de novo.) (рис. 15). Кодирующая часть гена дистрофина (кДНК) длиной 14 Кб, условно подразделенная, начиная с 5'-конца гена, на субфрагменты размером 1 Кб, была получена в виде 9 отдельных клонов: 1-2, 3, 4-5Ь, 6а- 7, 8, 9-10, 11аИ2Ь, 13и 14 (Koenig М. eta/., 1987) (рис. 15А). Каждый из клонов может быть использован в качестве зонда для ДНК-исследований. В приводимом примере в Hind lll-рест- рицированной ДНК больного блот-гибридизацией с зондом кДНК 8 выявлено отсутствие отдельных фрагментов, соответствующих центральной области гена (рис. 15 Б, В).

Подобные крупные мутации генов стало возможно легче и быстрее определять, с развитием описанной выше ПЦР-тех- нологии, причем в случае мультиплексной (мультилокусной) ПЦР в одной пробирке можно провести тестирование сразу нескольких разных ДНК-локусов. На рис. 16 показаны некоторые осуществленные нами случаи детекции делеций крупных регионов (экзонов) гена дистрофина у больных МДД методом мультиплексной амплификации с набором специфических праймеров, фланкирующих отдельные области гена. Наличие делеций устанавливается по отсутствию соответствующих продуктов амплификации при электрофоретическом анализе ам- плификатов. В приведенном примере можно видеть у больных №2 и №6 отсутствие фрагмента ДНК, соответствующего экзо- ну 45; у больного №3 - нет экзона 44; в образце ДНК больного №4 выявляется более протяженная делеция, захватывающая экзоны с 8 по 19; в случае №5 обнаружен дефект экзона 48.

Определяя точно размер анализируемого фрагмента ДНК, можно анализировать и небольшие мутации гена. Рассмотрим на примере ПЦР-диагностики самой частой мутации при му- ковисцидозе (D F-508) - делеции трех пар нуклеотидов, кодирующих одну аминокислоту (фенилаланин) в 508-положении белкового продукта гена муковисцидоза (рис. 17). На рис. 18 приведены результаты обследования семьи, в которой один из сыновей - больной муковисцидозом. Молекулярно-генети- ческий анализ показал наличие у больного (№2 - отмечен стрелкой) вместо нормального фрагмента ДНК длиной 91 параоснований укороченного фрагмента длиной 88 п.н. Носителями такого же укороченного фрагмента гена являются родители пробанда (№1 и 4), Важно и то, что носителем патологического гена является и здоровый брат пробанда. Ему (его будущей семье) рекомендовано в последующем (при вступлении в брак) медико-генетическое консультирование для прогноза потомства. Поскольку носителем мутаций гена муковис- цидоза в европейских популяциях является один из 20-25 человек, высока вероятность появления у него больного ребенка.