Транскрипция и трансляция

Ген - это сложная структура, которая определяет не только структуру белка, но и весь путь от ДНК через транскрипцию- матричной РНК к трансляции белка. Мутации в различных структурных частях гена могут проявляться на стадии транскрипции или трансляции. Маккьюсик (McKusick, 1992) выделяет следующие типы мутаций: Мутации транскрипции:

мутации в области промотора;

мутации сплайсинга РНК, в том числе мутации в 5 -донор- ном сайте интрона, мутации в З'-акцепторном сайте ин- трона и мутации, приводящие к возникновению новых сайтов сплайсинга;

мутации расщепления мРНК (мутации полиаденилирова-

ния);

мутации кэп-сайта;

делеции активирующих районов или энхансеров.

Мутации трансляции:

мутации в инициирующем кодоне (ATG) или вблизи него,

мутации сдвига рамки считывания (результат делеции или инсерций);

миссенс-мутации - замены одного аминокислотного остатка в молекуле белка на другое. Миссенс-мутации тоже могут приводить к нарушению экспрессии гена, поскольку новая структура РНК или белка может оказаться нестабиль-

Ннонсенс-мутации ("стоп^мутации) - мутирование кодона в терминирующий кодон, что приводит к образованию укороченного белка; А

мутации в терминирующих кодонах (ТАА, ТАG или TGA), которые приводят к синтезу длинных (длиннее нормального) белковых продуктов.

Существуют и другие типы изменений генетического материала, приводящие к фенотипическим изменениям. Например, при транслокациях или других хромосомных перестройках структурная часть гена и его промоторная области могут оказаться разделенными, что приведет к нарушению генной экспрессии (пример - различные типы лейкемии). Недавно открыт новый необычный тип мутаций - экспансия тринуклеотид- ных повторов (значительное увеличение числа повторов у больных по сравнению нормой), ответственный за синдром фра- гильной Х-хромосомы, миотоническую дистрофию и ряд других болезней (см. главу 5).

Мутация будет передаваться по наследству только в ton/ случае, если она произошла в половых (герминальных) клетках. Мутации же в соматических клетках (соматические мутации) являются причиной спорадических (несемейных) случаев различных форм рака. Некоторые из таких мутаций возникаю- также и в половых клетках и передаются в поколениях как пред расположенность к раку (например, ретинобластома, синдрок Ли-Фромени).

В некоторых случаях мутации, летальные в половых клет ках, могут существовать в соматическом виде в части клето! организма (мозаицизм), приводя к менее тяжелым аномалиял (пример - наследственная остеодистрофия Олбрайта).

49. Принцип и применение блот-гибридизации по Саузерну.

Используют для локализации отдельных последовательностей в рестрикционных фрагментах ДНК(рестрикция- разрез цепочки ДНК, осуществляемый специальным ферментом (рестриктазой)) Этапы гибидизации:! Выделяется ДНК из любой ядросодерж ткани(цаще из крови) 2. Тотальная ДНК обрабатывается 1 определенной рестриктазой в результате получается набор из ограниченного числа фрагментов разной длины. 3. Проводят электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле в результате фрагенты распологаются от своего молекулярного веса. 4. После на гель кладут нитроцеллюлозный и нейлоновый фильтр и ырагменты ДНК осмотическим током жидкости перемещаются с влажного геля на фильтр,этот процесс длится около 12-24 часов и его скорость зависит от размера фрагмента. 5. При переносе в щелочную среду ДНК денатурирует приобретает одноцепочечное состояние в таком состоянии он способен гибридизоваться с меченым ДНК-зондом(хим синтезированный одноцепочечный фрагмент ДНК, который мечен либо радиактивной меткой, либо флюарисцентной) 6.Фильтр кладутв полиэтиленовый пакети туда же вносят раствор для гибритизации,котррый содержит обязательно буфер и зонд. 7. Инкубация 68-70 градусов12час и более. После этого фильтр промывают (радиоактивн-рентген пленкой,флюарисц-световой микроскоп) Метод можно использовать как для геномной ДНК(тотальной), так и для клонирования ДНК.

Принцип блот-гиб- ридизации ДНК по Саузерну показан на рис. 13. Анализ начинается с выделения ДНК из любой ядросодер- жащей ткани организма (из любого органа, ткани, культивируемых клеток). Обычно у обследуемого берется несколько мил-лилитров крови, а при пренатальной диагностике - амниоти- ческая жидкость или биоптат хориона. Выделенная клеточная ДНК обрабатывается одной из рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющей ДНК в строго определенных сайтах. В результате получается характерный для данного человека набор из огромного множества фрагментов различной длины, которые при электрофоретическом фракционировании в агарозном или полиакриламидном геле располагаются в зависимости от их • молекулярного веса: чем меньше фрагмент, тем выше скорость его миграции в геле. На следующей стадии происходит сам Саузерн-блоттинг (названный по имени доктора из Эдинбурга Эдмунда Саузерна, предложившего метод, а английское blot - означает промокать): фрагмент ДНК переносится осмотическим током жидкости из влажного геля на помещенный на него нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр. На фильтре получается реплика ДНК-рестрикта. При переносе в щелочной среде ДНК денатурирует, то есть переводится в одноцепочечное состояние, в котором она может гибридизо- ваться с меченым ДНК-зондом на исследуемый ген или ДНК- фрагмент. В зависимости от способа мечения (радиоактивный или флуоресцентный) гибридные фрагменты, соответствующие изучаемой ДНК-последовательности, выявляются авто- радиографически или с помощью флуоресцентной метки.

50. Принцип и применения полимеразоной цепной реакции.

Многократное увеличение ДНК. Позволяет оперировать очень маленким количеством ДНК. ДЛЯ ОСУЩ РЕАКЦИИ НЕОБХОДИО: 1. сама аналир ДНК. 2. Олигонуклеотидные праймеры,комплементарные огранич послед-м анализируемого уч ДНК. Праймеры-прямойF -обратный R.(от 3штрих). 3. Дезоксирибонуклеотид 3 фосфат (dNTP,dATP,dTTP,dCTP,dGTP) для того чтобы достраивать цепи путем достройки праймера. 4. Таd-ДНК-полимераза оптим температура 72градус(фермент может присоединять колосальное количество 15тыс нуклеотидов в 1 мин) 5. Буфер создается под полимеразу(ожет содержать К,Мq,но обяз компонентами являются КОНСОЛЬВЕНТЫ,вещества поддерживающие ДНК в одноцепочечном состоянии) ПЦР процесс: 1.Денатурация при темп от 95-97(рвутся водородные связи) 2. Специфическое связывание праймеров с одноцепочечной матрицей ДНК,назыв ОТЖИГ,темп от50-70 от зависимости от локуса. 3. Синтез достраиваемого праймера с 3 конца путем присоединения dNTP ферментативный синтез ДНК72 оптим. Послед проходят 3 этапа- ЦИКЛ,один этап- ШАГ. Повторение циклов ведет к множественной аппликации ДНК(многократное увеличение) Специфичность ПЦР обеспечивается праймерами. Имеют длину от20-30 нуклнотидов(опти 22-23)чем короче, тем легче присоедин. ТРЕБОВАНИЯ: -длина,-сод-е G---C пардолжно рпев 70гр,-должны иметь примерно одинаковую температуруплавления,-F и R,не должны содержать более чем 3,4 нукл комплементарных друг к другу,. В результате циклического повтора происходит накапливание продукта и по экспоненте 2в степени n-2n, где n-число циклов. ПЦР ведется в спец-х приборах- амплификаторах или термоциклеры. Из1 фрагментаДНК получ 10 в 9 степени фрагментов. Применение ПЦР: 1. Диагностика инф заболевания. 2. Диагностики наследств-х заболеваний. 3. В судеб медицине. 4. В научных исслед. 5. определение отцовства, материнс.тва

Полимеразная цепная реакция (амплификация ДНК in vitro). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой ферментативный синтез фрагментов ДНК. В пробирке с помощью ДНК-полимеразы синтезируют цепочку ДНК, комплиментарную исходной молекуле-матрице. Реакционная смесь содержит, кроме фермента и матрицы 4 дезоксинуклеотид- трифосфата, и 2 короткие цепочки ДНК (праймеры), комплиментарные концам размножаемого участка. Реакционную смесь вначале нагревают, чтобы разделить двухцепочечную матрицу, затем охлаждают, чтобы праймеры связались с комплиментарной им последовательностью, и полимераза построила вслед за праймерами всю цепочку. Циклическое повторение нагревания и охлаждения приводит к экспоненциальному росту числа копий матрицы, поскольку каждая новая двухце- почечная копия вновь разделяется и сама служит матрицей для следующего цикла синтеза. За полтора часа можно провести 30 таких циклов, что приведет к увеличению числа копий нужного фрагмента в миллионы раз.

Большая скорость амплификации, точность и простота (что дает возможность полностью автоматизировать реакцию) выгодно отличают ее от технологии рекомбинантных ДНК. Однако ПЦР имеет и некоторые недостатки. Основные из них - необходимость иметь предварительную информацию б амплифицируемом участке (нужно знать последовательность праймеров) и невозможность амплифицировать большие фрагменты (больше нескольких тысяч и.о.)