Главная Случайная страница Контакты | Мы поможем в написании вашей работы! | ||
|
Локализация генов при анализе генетического сцепления или межвидовой гибридизации клеток представляет собой непрямые методы картирования, поскольку основывается на корреляции между признаком и хромосомой при передаче в ряду поколений или клеточных клонов. Молекулярная генетика, в особенности технология рекомбинантных ДНК, дает в руки исследователей инструмент, позволяющий работать с носителями генетической информации (хромосомами, молекулами ДНК, отдельными генами) непосредственно. Генетические карты, которые строятся на основе прямого исследования генетического материала, называют физическими.
Различные методы физического картирования позволяют получить карты с различной степенью детализации. Общая закономерность такова, что чем более детальна карта, тем меньший участок генома можно картировать в ходе отдельного эксперимента. Карта с самым низким уровнем разрешения - хромосомная (ее иногда называют цитогенетической), которая отражает различия в окраске бэндов при наблюдении в световой микроскоп и позволяет охватить весь геном. Карта кДНК показывает расположение экспрессируемых участков (экзонов) на хромосомной карте. Более подробная карта кос- мидных контиг отражает локализацию наборов перекрывающихся фрагментов ДНК, охватывающих небольшие участки генома. Рестрикционные карты фиксируют порядок расположения на молекуле ДНК сайтов рестрикции и расстояние между ними. Самая подробная из физических карт - последовательность нуклеотидов. Однако, одномоментно можно секве- нировать лишь очень небольшие (по сравнению со всем геномом) фрагменты ДНК.
Мелкомасштабные физические карты
К мелкомасштабным картам (физическим картам с низким уровнем разрешения) относятся хромосомные карты и карты кДНК.
При определении положения гена на хромосоме первоначально стоит задача приписать его к определенному хромосомному сегменту - бэнду или группе бэндов, который можно идентифицировать цитогенетически. Сейчас для этого используют метод гибридизации in situ. Клонированную копию нужного гена помечают радиоактивной (например, тритиевой или фосфорной) или флуоресцентной меткой. Меченый таким образом фрагмент ДНК называют зондом. Затем зонд инкубируют с метафазным препаратом хромосом и, после того как он свяжется с комплиментарной цепочкой ДНК на интактнои хромосоме, устанавливают его точную локализацию. С помощью гибридизации in situ было картировано множество генов человека, в том числе гены альбумина, коллагена, альфа-глобина,
гормона роста.
До недавнего времени даже самые подробные из хромосомных карт позволяли локализовать фрагмент ДНК с точностью до региона размером примерно 10 Мб (средний размер хромосомного бэнда). Усовершенствования метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) позволили увеличить разрешение хромосомных карт до 2-5 Мб. Модификации методов гибридизации, использующие хромосомы на стадии интерфазы, когда они менее компактны, дают возможность локализовать зонд до участка размером в 100000 п.о. (0,1 Мб).
Карта кДНК отражает расположение на хромосоме кодирующих последовательностей. ДНК-копию (кДНК) синтезируют в лаборатории, используя в качестве матрицы молекулы мРНК, вносят метку и локализуют кДНК-зонды методом гибридизации in situ. Представляя экспрессируемые участки, кДНК поз- воляет выявить наиболее значимые с биологическои и медицинской точек зрения районы генома. Карта кДНК может помочь в хромосомной локализации генов, функция которых еще неизвестна. ДНК-копию можно получить и в том случае, если белок синтезируется в очень небольших количествах и выделить специфическую мРНК из общей смеси мРНК клетки не удается. Зная последовательность аминокислот в белке, можно «воссоздать» последовательность гена искусственно или выделить его из клонированной геномной ДНК при гибридизации со смесью олигонуклеотидов, соответствующих всем возможным кодирующим последовательностям гена (вследствие вырожденности генетического кода их может быть несколько).
Крупномасштабные физические карты
Существует два общих подхода к построению физическои карты участка генома с высоким уровнем разрешения: картирование "сверху вниз" (макрорестрикционная карта) и снизу вверх" (карта контиг). В обоих случаях карта представляет собой упорядоченный набор фрагментов ДНК. Фрагменты размножают клонированием или с помощью полимеразнои цепной реакции, разделяют гель-электрофорезом и выявляют при окрашивании или гибридизации с меченым зондом. Для воссоздания оригинальной последовательности фрагментов (той последовательности, в которой они находятся в геноме) используют различные методы поиска перекрывающихся участ-
КОВ
Методы физического картирования можно применять к изолированным хромосомам человека. Отдельные изолированные хромосомы получают путем сортировки хромосом в потоке (метод проточной цитометрии) по их размеру. Существуют также гибридные клеточные линии, содержащие отдельные хромосомы человека. Для получения таких линий клетки человека гибридизуют с опухолевыми клетками млекопитающих (как правило, грызунов). В процессе деления гибридные клетки теряют предпочтительно хромосомы человека. Когда в гио- ридной клетке останется лишь одна человеческая хромосома, ее размножают и поддерживают как клеточную линию.
Необходимой ступенью при построении крупномасштабных физических карт является получение большого количества фрагментов ДНК картируемого участка. Существует два основных способа амплификации ("размножения) ДНК - клонирование и амплификация в полимеразной цепной реакции.
Дата публикования: 2014-11-03; Прочитано: 2172 | Нарушение авторского права страницы | Мы поможем в написании вашей работы!