Занятие 7. Методы количественного анализа белков

7.1. Общие замечания. Известно, что белки составляют половину и более сухой массы большинства клеток. Пластичность их полипептидной структуры позволяет белкам играть роль главных «молекулярных машин» в любой клетке и организме. Наконец белки – важнейший источник азота в питании, а, следовательно, росте и развитии консументов. Поэтому определение белка играет первичную = опорную роль во всех количественных исследованиях по энзимологии и биологии клеток, служит основой оценки физиологии и патологии организмов и их популяций, а также – важнейшим критерием оценки качества = эффективности пищевых цепей.

Соответственно задачам и возможностям лабораторий, методы измерения концентрации белков (табл. 7.1) многочисленны и разнообразны. Очевидно, что рефрактометрия (лат. Refractus – преломление) позволяет быстро и просто определять процентные концентрации белка в двухкомпонентных растворах. Гравиметрия – зависит от чувствительности лабораторных весов и требует чистого препарата, высушенного до постоянной массы. Принцип и формула расчета фотометрии белков в УФ, уже приводились в таблице 4.3.

Таблица 7.1

Методы измерения концентрации белков

До 70-х гг. прошлого века, наиболее точным (10^-5 г/л), считалось определение белка по количеству азота. Исходя из того, что в подавляющем большинстве белков, за исключением гистонов и протаминов, содержание азота близко к 16 %, считалось достаточным умножить найденную величину на эмпирический коэффициент 6,25 и, получить содержание белка в препарате. Однако, необходимость минерализации препарата в серной кислоте и последующее определение аммиака, занимали часы-сутки. Из-за длительности и трудоемкости этих процедур, сейчас этот метод применяют редко. По близким причинам, измерение концентраций белка на основе анализа аминокислот, используют лишь в специализированных лабораториях.

С 50-х гг. ХХ в., чаще всего в биохимической литературе цитировали работу Lowry и соавторов, предложивших измерять концентрации белков сочетанием биуретовой реакции с реактивом Фолина-Чиокалто (1927), дающим интенсивную темно-синюю окраску с тирозином, фенилаланином и, меньше с такими аминокислотами, как Три, Гис, Цис. К сожалению, его линейность, сохраняется лишь в узком диапазоне концентраций. Большинство модификаций этой методики сводится к попыткам устранить влияние специфических реагентов, применявшихся при выделении белков. В последние годы появились методы связывания красителей и флуорометрии, если в белке имеется, или, без потери нативных свойств, в него вводится соответствующий маркер. Достоинства и недостатки этих методов сведены в таблицу 7.2.

Таблица 7.2

Сравнение достоинств и недостатков методов измерения количества белка (По Р. Скоупс, 1985 с изменениями)

Дополнительная литература

7.2.1. Бурштейн Э. А. Люминесценция белковых хромофоров. – М.: ВИНИТИ. Биофизика. Т.6,1976. – 216 с.

7.2.2. Аранович Г. И. и др. Справочник по физико-химическим методам исследования объектов окружающей среды. – Л.: Судостроение, 1979. – 648 с.

7.2.3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – С. 310 – 315.

7.2.4. Практикум по биохимии. Под ред. С. Е. Северина и Г. А. Соловьевой. – М.: Изд-во Московского университета, 1989. – С. 80 – 88.

7.2.5. Троицкий Г. В. Дефектные белки. Постсинтетическая модификация. – Киев.: Наукова думка, 1991. – 232 с.

7.2.6. Tиц Н. и др. Руководство по клиническим лабораторным тестам. – М.: Пер. с англ. под ред. В. В. Меньшикова, 1997. – 960 с.

7.2.7. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. – МЕДПРЕСС-ИНФОРМ, 2004. – 920 с.