Экспериментальная часть. Проводится в соответствии со схемой на рис

Проводится в соответствии со схемой на рис. 6.3:

Рис. 6.3. Схема деления крови на фракции (пояснения в тексте)

6.3.1. Деление плазмы и форменных элементов крови = ФЭК

1. В маркированную центрифужную пробирку внести 1-2 мл крови с добавкой антикоагулянта: 0,5 % гепарина; 0,2-0,5 % Трилона Б = динатриевой соли этилендиаминотетраацетата = ЭДТАNa₂ и т.п.

2. Зафиксировав в протоколе занятия исходный объем крови, поместить пару пластиковых гильз центрифуги на чашки центрифужных весов и вставить в них пробирки с кровью.

3. Определить, какая чашка легче и, в ее гильзу, но не пробирку, добавить для уравновешивания из пипетки по каплям дистиллят. ВНИМАНИЕ! Во избежание повторения процедуры с другой чашкой, опасаться передозировки!

4. Уравновесив гильзы с пробирками, установить их в противоположные по диаметру гнезда ротора центрифуги ОПН-3.

5. Дежурный студент, убедившись, что на задней панели центрифуги переключатель скорости вращения находится в положении 2 – 2000 об/мин и, дождавшись повторения пп. 2-4 всей подгруппой, закрывает прибор крышкой и, вставив его вилку в сетевую розетку, клавишей на передней панели включает вращение ротора. Затем, повернув по часовой стрелке рычаг на циферблате таймера, устанавливает время – 10 мин., убедившись по звуку, что он действует.

6. По звонку таймера, клавишей на передней панели центрифуги – отключить прибор.

7. Дождавшись полной остановки ротора и, сняв затем крышку центрифуги, осторожно, чтоб не взмутить рыхлый осадок ФЭК, перенести свою пробирку из гильзы в штатив на столе. При наличии воды в гильзе – выплеснуть ее в раковину водопровода.

8. С помощью полуавтоматического дозатора или пипетки с грушей, аккуратно отсосать из центрифужной пробирки по возможности весь надосадок, перенося чистую плазму крови в новую маркированную пробирку для выполнения работы 6.3.3.

9. Зафиксировав в протоколе занятия полученные объемы плазмы и эритроцитов, осторожно, чтобы не вызвать гемолиза, к осадку последних добавить 2-3 мл физиологического раствора, суспендировать его и повторить операции пп. 2-7.

10. Слив надосадок в раковину водопровода, использовать однократно промытый осадок ФЭК в работе 6.3.2.

6.3.2. Разделение гемоглобина и теней эритроцитов

1. Добавить к осадку ФЭК 2 объема дистиллята и 1 каплю хлороформа для ускорения осмотического гемолиза.

2. Закрыв горло пробирки пробкой, обернутой полиэтиленовой пленкой или алюминиевой фольгой, энергично встряхнуть ее содержимое и поставить пробирку в штатив на 30 мин., периодически встряхивая для ускорения полноты гемолиза.

3. Уравновесив пробирки на центрифужных весах аналогично пп. 2-7 работы 6.3.1, центрифугировать гемолизаты 20 мин. при 2000 об/мин.

4. Красный надосадок водного раствора гемоглобина количественно перенести в чистую, четко промаркированную пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение в холодильнике лаборанту, для работ на следующих занятиях.

5. Перевернув пробирку вверх дном, подсушить плотный белесый осадок на фильтровальной бумаге.

6. Аналогично п. 4 данной работы, четко маркировать пробирку и, закрыв ее пробкой, сдать на хранение лаборанту, как препарат теней (уст. – стромы) эритроцитов. При желании, небольшую часть материала стоит микроскопировать с большим увеличением.

6.3.3. Высаливание белковых фракций плазмы крови и их

количественная нефелометрия

Основаны на способности белков, в зависимости от прочности их гидратных оболочек, оседать из раствора при определенных концентрациях фосфатных солей. Степень помутнения растворов, определенная нефелометрией на ФЭКе КФК-2, пропорциональна содержанию белка в соответствующей фракции.

1л основного фосфатного буферного раствора содержит: 67 г. NaOH и 463,6 г. К₃РО₄. Соотношение объемов рабочих буферных растворов – в таблице 6.1.

Таблица 6.1

Состав рабочих буферных растворов.

1. В соответствии с таблицей 6.2 поместить в 6 пронумерованных центрифужных пробирок:

Таблица 6.2.

Состав проб, мл для высаливания белковых фракций плазмы

2. Пробы тщательно перемешать и, точно через 15 мин с момента добавки препаратов, измерить величины А растворов на ФЭКе с красным светофильтром, в кювете толщиной 5 мм против контроля. 3. Убедившись в надежной маркировке проб, плотно закрыть их пробками и сдать образца на хранение лаборанту для работы на следующих занятиях.

4. Для каждой фракции белков плазмы рассчитать истинное значение А по формулам: Сывороточный альбумин = СА = А3 - А4;

α–глобулины = А4 - А5;

β–глобулины = А5 - А6;

γ–глобулины = А6.

5. Полученные истинные значения А для всех фракций суммировать и, приняв найденную величину за 100 %, рассчитать по формуле:

В норме, плазма крови млекопитающих содержит 60-80 г/л белка, из которых 35-50 г/л СА и 25-30 г/л глобулинов. Т.е. отношение альбумина к глобулинам = индекс А/Г лежит в пределах 1,5-2,3. Отсюда, относительное содержание CА в плазме крови составляет 55%, α–глобулинов – 10-18%, β–глобулинов – 8-14% и γ – глобулинов – 12-22%. Данные величины, как важнейшие константы гомеостаза, изменяются лишь при тяжелых кровопотерях, воспалительных и инфекционных заболеваниях и, крайней степени белкового голодания – маразме.

Вопросы для самоконтроля

6.4.1. С позиций биологии, определите понятие «ткань».

6.4.2. Какие разновидности биотканей вам известны?

6.4.3. Определите понятие «дифферон» и приведите их примеры.

6.4.4. Можно ли биохимические методы анализа назвать неразрушающими?

6.4.5. Чем различаются основные подходы к биохимическому анализу и в чем состоит залог его успеха?

6.4.6. В чем могут заключаться подготовительные операции при биохимическом анализе?

6.4.7. В каком температурном режиме хранят материал и выделяют биохимические препараты?

6.4.8. Почему нет единого алгоритма для выделения биомолекул?

6.4.9. Сформулируйте основные этапы препаративной биохимии.

6.4.10. Назовите основные этапы диагностической биохимии.

6.4.11. Какие способы разрушения тканей и клеток вам известны?

6.4.12. Почему ткани животных разрушать проще, чем клетки прокариот и ткани растений?

6.4.13. Какими приемами удаляют из гомогенатов недостаточно разрушенный материал?

6.4.14. Какие принципы могут лежать в основе разделения смеси биомолекул?

6.4.15. Какие факторы нужно учитывать при экстракции или осаждении биополимеров из смеси?

6.4.16. Что такое «высаливание» и зачем оно применяется?

6.4.17. Какие методы применимы для удаления или замены низкомолекулярных веществ в гомогенатах?

6.4.18. Что такое «молекулярные сита» и на каком принципе основано их применение? Назовите синонимы этого метода?

6.4.19. Почему различия в фазовых переходах сравнительно редко применяются к разделению биомолекул?

6.4.20. Какие методы разделения макромолекул основаны на разнице в их размерах?

6.4.21. Что такое хроматография и, какие ее разновидности вам известны?

6.4.22. Что такое «изоэлектрическая точка» и чем она отличается от понятия «изоэлектрическое состояние»?

6.4.23. Что вы знаете об электрофорезе и, чем он отличается от изоэлектрофокусирования?

6.4.24. Какие способы концентрирования растворов вам известны?

6.4.25. Как убедиться в гомогенности и нативных свойствах препарата?