Твердофазні імуносорбентні методи дослідження

Імуноферментний і радіоімунний аналізи (ІФА і РІА)

ІФА і РІА – імунологічні реакції між антигеном і гомологічними антитілами.

ІФА і РІА проводяться у ряд послідовних етапів:

перший відомий компонент реакції (це можуть бути антитіла або антиген) сорбують на тверду фазу (лунки полістиролових планшетів);

досліджувані проби (з антигенами або, відповідно, антитілами) вносять в рідкому, розчиненому вигляді та інкубують;

відмивають тверду фазу від незв’язавшихся неспецифічних антитіл (антигенів), на ній залишається тільки прореагувавший комплекс антиген-анитіло;

На кінцевому етапі в ІФА і РІА використовують антитіла (антигени), мічені ферментом (в ІФА) або або радіонуклідом, звичайно ¹²⁵І (в РІА).

У багатьох тест-системах, наприклад, ІФА-ВІЛ ½-О. ІФА-анті-ДЕЛЬТА М, ІФА-АНТІ-HEV та інших до зв’язаного комплексу “антиген-антитіло” вносять імуноферментний конїюгат, мічений пероксидазою хрону. Окрім пероксидази хрону в різних тест-системах ІФА використовують і інші природні ферменти – лужну фосфатазу, b-лактазу, каталазу тощо.

Після наступного відмивання незв’язавшегося кон’югата до лунок планшету додають забарвлюючий субстрат пероксидази – ортофенілендіамін..

У ІФА результати визначають щляхом візуального або інструментального визначення інтенсивності забарвлення компонентів реакції (за допомогою рідера або спектрофотометра), а. в РІА – за рівнем радіоактивності (за допомогою g-лічильників).

У ІФА використовують субстрати, що під дією ферменту переходять у забарвлену розчинну (1) або нерозчинну (2) форму.

До групи 1 належать ортофенілендіамін, парааміносаліцилова кислота, хлоронафтол, р-нітрофенілфосфат та інші.

До групи 2 відносяться бензидин, діамінобензидин.

Технологія одержання тест-систем ІФА і РІА має основними етапами

одержання вірусного антигена;

одержання гіперімунної сироватки та противірусних антитіл, міченіх ферментом, або ¹²⁵І.

Одержання вірусних антигенів грунтується на застосуванні традиційних (культивування вірусів) і нетрадиційних (біотехнологія та хімічний синтез) методів. Природні антигени застосовують у вигляді нерозведених віріонних препаратів, окремих структурних білків вірусів, клітин тканин, інфікованих вірусом, або лізатів інфікованих клітин. Працюючи з некультивованими (або погано культивованими) віруспми, використовують биологичний матеріл від хворих або померлих від вірусної інфекції людей та тварин.НВ-антиген одержують із плазми носіїв, вірус гепатиту А. Кишкові віруси – з калу хворих, вірус гепатиту D (дельта-агент) – з печінки людей, які померли від дельта-гепатиту, і з печінки експериментально інфікованих бабаків.Синтетичні антигени – у вигліди пептидів, одержаних шляхом мікробіологічного або хімічного синтезу. Так, під час серологічної діагностики ВІП-інфекції (СНІДу) в ІФА, крім природного антигена, одержуваного за допомогою культивування ВІЛ у культурах Т-лімфоцитів, використовують хімічно синтезований пептид пептоскрин.

В набір для імуноферментного аналізу вірусу імунодефіциту людини – “ІФА-ВІЛ ½-0” входить суміш рекомбінантних поліпептидів – аналогів поліпептидів ВІЛ-1 та ВІЛ-2 (Env ВІЛ-1, Gag ВІЛ-2, Env-ВІЛ-3), синтезованих в бактеріях кишкової палички (Escherichia coli). Ці пептиди повністю біологічно безпечні, але присутність в тест-ситемі деяких біологічних компонентів (сироваток, плазми крови) та хімічних речовин потребує реалізації методів безпеки:

- робота повинна проводитись в спеціально оборудованому приміщенні;

необхідно працювати в гумових рукавичках;

розчини не піпетувати ротом;

всі рідкі відходи обробляти 4% розчином хлораміну або 6% розчином перекису водню на протязі 3 годин;

всі тверді відходи збирати в спеціальний контейнер і потім автоклавувати 1 годину при 120^оС;

інструменти, прилади та поверхня, на яких проводився аналіз, необхідно до та після роботи протирати 70%-ним етанолом.

Вірусні антигени, використовувані в ІФА і РІА як стандартні антигени (тобто позитивний контроль антигена) мають відповідати певним вимогам. Сорбований на твердій фазі антиген має бути очищеним. Очищення вірусу проводять за допомогою методів кльтрацентрифугування, хроматографії та ультрафільтрації. Концентрація вірусного антигена становить 10 – 20 мкг/мл. Працюючи з особливо небезпечними вірусами (Ласса, ВІЛ та ін.). використовують неінфекційні препарати, інактивовані формаліном, дією УФ-опромінення, детергентів тощо.

Джерелом одержання противірусних імуноглобулинів для конструювання імуносорбентних тест-систем є поліклональні імуносорбентні сироватки або асцитичні рідини, моноспецифічні сироватки (проти окремих структурних білків вірусу), моноклональні антитіла (антитіла певного класу проти конкретної антигенної деиермінанти вірусу). Використовують також жовтки яєць імунізованих курей, сироватки крові реконвалесцентів (у разі вірусного гепатиту А) та носіїв (у разі ВІО-інфекції). Імуноглобуліни використовують в концентрації 2 – 10 мкг/мл.

До переваг твердофазних імуносорбентних метоів належить вичока чутливість і специфічність, швидкість, точність і відтворюваність, можливість стандартизації одержаних даніх, дослідження микрооб’ємів,видносна просотота системи реєстрації результатів.

Дещонижча чутливість ІФА (у 5 – 10 разів) порівняно з РІА зумовлена меншою чутливість методів виявлення забарвлених молекул, ніж визначення радіоактивності.

Чутливість тест-систем визначають шляхом титрування антигена (референс-препарату) з відомою концентрацією за білком (або вірусними частками), що становить 1 – 5 нг. Під чутливістю розуміють також кількість (%) позитивних результатів під час дослідження стандартного набору (комплекту) імунних сироваток, у яких містяться (за даними біль чутливого методу) противірусні антитіла.

Специфічність визначають як кількість (%) негативних результатів під час дослідження стандартного набору (комплекту) імунних сироваток, що не мають противіруснихі антитіл. Крім того, специфічність можна розуміти як можливість тонкої імунологічної диференціації вірусних антигенів і антитіл до них.

Висока специфічність імуносорбентних тестів визначається характеристикою антитіл, використовуваних для конструювання детекторних тест-систем і проявляється у можливості диференціації вірусних антигенів на групо-, підгрупо-, типо-, підтипо- та штамоспецифічні, а також у виявленні антигенних аріантів вірусу навіть у межах одного штаму.

Твердофазні імуносорбентні методи використовують для експрес-діагностики, виявлення вірусного антигена у досліджуваних пробах або противірусних антитіл класу М у сироватці крові хворого в гострий період інфекції.

Ретроспективну серологічну діагностику використовують за умови роботи з кількома вірусними інфекціями (грип, парагрипозні, аденовірусні, ентеровірусні та інші інфекції). Грунтується вона на виявленні збільшення титру противірусних антитіл у 4 рази і більше під час дослідження парних сироваток крові; при вірусних гепатитах A, B, C, D, E, ВІЛ-інфекції та деяких інших.

Метод флюоресциюючих антитіл (МФА)

МФА застосовують для виявлення вірусних антигенів в патологічному матеріалі (мазки з носової частини глотки, з біоптатів, мазки-відбитки з трупного матеріалу, інфіковані культури клітин), а також антитіла в сироватках крові осіб, які перехворіли на вірусну інфекцію.

МФА грунтується на взаємодії антигена з відповідним антитілом, мічения флюоресциюючими барвниками. Серед багатьох запропонованих флюорохромів в практиці найширше використовують ФІТЦ (флюоресцеїнізотіоціанат), що зумовлює люмінесценцію зеленого кольору, і родамін, який дає люмінесценцію червогого кольору.

Під час дослідження в люмінесцентному мікроскопі (в ультрафіолетовому спектрі) утворений специфічний комплекс антиген-антитіло виявляється за світінням.

МФА дає змогу провадити експрес-діагностику більшості вірусних інфекцій: натуральної віспи, сказу, простого герпесу, вітряної віспи й оперезуючого лишаю, ротавірусних гастроентеритів, грипу, парагрипу, аденовірусної, респіраторно-синцитіальної, рино- та арбовірусної інфекції. Кору, поліоміеліту, інших ентеровірусних інфекцій, червоної висипки, СНІДу та ін.

На препарат з фіксованими інфікованими клітинами наносять на 30 хв специфічну люмінсціюючу сироватку (кон’югат), потім надлишок її зливають, препарат промивають і досліджують у люмінесцентному мікроскопі.

Метод МФА застосовують у трьох основних модіфікаціях: прямого, непрямого методів і методу антикомплементарної імунофлюоресценції.

За допомогою прямого МФА виявляють вірусні антигени в інфікованих клітинах.

Метод непрямого МФА складається з двох етапів. На першому відбувається взаємодія антигена з неміченим антитілом. На другому – немічене специфічне антитіло зв’язується з антивидовим мічениям антитілом.Антивидові антитіла одержують шляхом імунізації одного виду тварин сироваткою іншого виду тварин або людини.Потім антивидові імуноглобуліни мітять ФІТЦ.

За допомогою непрямого методу можна виявляти як вірусні антигени і інфікованих клітинах, так і антитіла (зокрема IgM) у сироватках крові хворих і осіб, які перехворіли на вірусну інфекцію.