Молекулярна гібридизація нуклеїнових кислот

Певну послідовність нуклеотидів, що складає генетичну інформацію можна ідентифікувати з абсолютною специфічностю шляхом гибридизації з комплементарною копією, використовуючи як зонд нуклеїнову кислоту, позначену радіоактивною міткою або кон’юговану іншим способом. Розвиток технології виробництва рекомбінантних ДНК і методів хімічного синтезу нуклеїнових кислот дав змогу одержувати зонди будь якої специфічності. За допомогою методу стало за молжливе виявити РНК і ДНК збудника інфекції в клінічному матеріалі (кров, виділення з носової частини глотки, слина, кал, матеріал, одержаний під час біопсії тощо). Цей метод незамінний для ідентифікації вірусів, що не культивуються в лабораторних умовах, для персистуючих вірусів, для виявлення провірусу (вірусспецтфічної інфекційної послідовності в клітинному геномі). За допомогою молекулярної гібризизації було виявлено кищкові аденовіруси (типи 40, 41) у калі, віруси папіломи в клітинах пухлин (рак шийки матки) та інши збудники інфекцій, визначено типи і варіанти їх.

Принцип методу полягає в слідуючому. Молекула клітинної ДНК складається з двох ланцюгів, зв’язаних водневими зв’язками.Під час нагрівання при температурі 100^оС або обробки лугом водного розчину ДНК водневі зв’язки руйнуються, і подвійна спираль дисоціює на два окреми ланцюжки.Цей процес називається денатурацією ДНК. Проте у разі тривалої експозиції при температурі 65^оС одноланцюжкові ДНК можуль легко утворити дволанцюжкову спираль, ідентичну вихідній; такий процес називається ренатурацією або гібридизацією. Реакція гібридизації може відбуватися між будь-якими двома одноланцюжковими нуклеїновими кислотами (ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК) за умови, якщо вони мають комплементарні нуклеїнові послідовності.

Один з ланцюжків можна позначити маркером, і за допомогою цього ланцюжка виявляти в досліджуваному матеріалі комплементарні йому послідовності.

Швидкість реассоціації залежить від багатьох умов, з них найважливішими є температура реакції та іонна сила розчину. Температура, при якій половина молекул нуклеїнової кислоти перебуває в дволанцюжковій формі, називається температурою плавлення. Реакція гибридизації має широкий температурний оптимум – від 30^оС до 15^оС, що нижче за температуру плавлення. Оптимально реакція відбувається при 0,4М Na⁺. На швидкість реакції впливає також в’язкість і рН розчину, кількість пар основ в дуплексі, концентрація формаміду в розчині тощо. Від цих самих умов залежить утворення стабільних гібридів і, отже, специфічність реакції.

Найбільш зручним і простим методом є гібридизація ДНК або РНК, імобілізованих на нерозчинному носії. У такому випадку нуклеїнова кислота, що аналізується, у одноланцюговій формі закріплюється на носії. До неї додають одноланцюжкові мічені зонди. Якщо утворюються гібриди, то вони ідентифікуються на носії (нітроцелюлозний фільтр), а негибридізовані молекули РНК 9ДНК) зондів відмиваються з носія. Швидуість гібридизації двє змогу зробити висновок про ступінь гомологічності двох молекул нуклеїнової кислоти, оскільки гібридизуються тільки комплементарні послідовності.

Нарізаючи ДНК або РНК ферментами, можна одержати олігонуклеотиди, які розділяють шліхом електрофорезу на агарозі або поліакріламідному гелі, а потім переносять на нітроцелюлозні фільтри (блот-гібридизація, або блотинг за Саузерном), і до кожного фрагменту додають мічений зонд для визначення ступеня гомології.

Зонди. Зондами називають РНК і ДНК, за допомогою яких у досліджуваному матеріалі виявляють комплементарні нитки. Для одержання зонду можна використовувати нуклеїнову кислоту, виділену з віріонів, або РНК, одержані шляхом транскрипції in vitro. Проте найдешевшим зондом є клонована рекомбінантна ДНК. Зонди мітять радіоактивними попередниками (звичайно радіоактивним фосфором) у реакції, що називається ніе-трансляцією. Ця реакція основана на розривах нитки ДНК ендонукдеазою і одночасному ковалентному приєднані до кінців розривів нуклеотидів, мічених радіоактивним фосфором (за допомогою кінцевої нуклеотидилтрансферази). Вадами цього методу є короткий період напіврозпаду радіоактивного іосіору та необхідність мати спеціальне устаткування для виявлення радіоактивності. Тому перспеутивнішим є застосування калориметричних реакцій. Для цього в молекулу зонда під час Нік-трансляціх вводять біотин, що може міцно зв’язувати авидин або стрептовіридин, у свою чергу вони зв’язані з ферментом (пероксидазою або лужною фосфатазою). У разі додавання до такого зонду субстрату виникає забарвлення, помітне неозбраєним оком.

Існує кілька варіантів методу гібридизації: на фільтрах, точкова гібридизація, блот-, сендвіч-, in situ, пряма в гелі та ін.

Точкова гібридизація дає змогу одночасно використовувати багато клінічних проб. На стандартні фільтри наносять виділені з проб ДНК і РНК. Якщо наявні двонитчасті структури, їх денатурують і після цього додають зонд. Метод використовують для виявлення вірусів цитомегалії, гепатиту В, рота-, ентеро-, парвовірусів, вірусів герпесу, грипу тощо.

Блот-гібридизація (от англ. blot – пляма) – метод виявлення фрагментів ДНК, розділених шляхом електрофорезу в агарозі. При цьому виділену з тканин та очищену ДНК нарізують рестрикційними ендонуклеазами на фрагменти.Після електрофорезу ці фрагменти переносять з агарози на нітроцелюлозні фільтри, на які наносять мічений зонд. Метод дозволяє визначити кількість вірусспецифічних послідовностей у виділеих з клітин ДНК. Застосовкється він і для виявлення в пухлинній тканині геномів вірусів інфекційного мононуклеозу, Епштейна-Барр, папіломи людини тощо.

Аналогічний метод можна застосовувати і для виявлення фрагментів РНК, проте його рідко використовують в діагностичній вірусології.

Сендвіч - гібридизація грунтується на використанні двох клонованих неідентичних фрагментів ДНК, один з яких імобілізований на фільтрі, а другий є зондом. Наявна у пробі комплементарна нитка гібридизується з обома нитками ДНК і зв’язує зонд з фільтром.Цей високочутливий метод дає змогу використовувати пробу без попередньої обробки. Його використовують для виявлення вірусів у виділеннях з носової частини глотки, вірусу цитомегалії в сечі тощо.

Гібридизацію in situ в заражених тканинах використовують для вивчення персистентних інфекцій та злоякісних пухлину разі інфекцій, спричинених вірусами гепатиту В, простого герпесу, інфекційного мононуклеозу тощо. При цьому використовують заморожені зрізи тканини, одержаної під час біопсії, та інші матеріали.

Реакція молекулярної гібридизації є високочутливою, вона дає змогу в оптимальних умовах виявити нуклеїнові кислоти у таких ниьких концентраціях, як 1-10 пг.Проте чутливість методу часто недостатня для виявлення вірусних послідовностей, якщо заражено небагато клітин в організмі. Наприклад, за умови ВІЛ-інфекції провірус звичайно знаходять лише в одному з 10⁵-10⁶ Т-лімфоцитів. У такому разі проводять попередню ампліфікацію вірусних нуклеїнових кислот шляхом додавання РНК затравки, комплементарної певним ділянкам обох ниток ДНК у консервативній ділянці молекули, і потім ідентифікують ДНК за допомогою зонда.