Індикація вірусів у живих системах

У п Діагностика вірусних захворювань заснована на застосуванні наступних методів:

а) вирусоскопический - виявлення специфічних включень в ураженій клітці Рис.. 8).

Включення розглядають як:

1) вогнища синтезу вірусу в клітці; 2) скупчення вірусних чи часток их білків; 3) реакцію кліток на присутність у них вірусу. У залежності від локалізації включення підрозділяють на ядерні, цитоплазматические і змішані.

Рис. 8. Типи вірусних включень

1.Клітка, заражена вірусом натуральної віспи (тельця Гварниери);

2.Клітка, заражена вірусом герпеса;

3. Клітка, заражена цитомегаловирусом;

4. Клітка, заражена вірусом аденовірусом; 5. Клітка, заражена вірусом віспи; 6) Клітка, заражена вірусом розповіді (тельца Бабеша – Негри).

б) імунної електронної мікроскопії (за допомогою електронного мікроскопа виявляють комплекс “вірус + специфічні проти даного типу вірусу антитіла”)

в) вірусологічний (віруси розмножують, визначають його титр і тип на культурах кліток, що розвиваються курячих ембріонах і на лабораторних тваринах);

г) серологический (від лат. Serum – сироватка, рідка складова частина крові) (иммуноферментный аналіз, реакція нейтралізації, реакція зв'язування комплементу, реакція пасивної гемагглютинации, реакція гальмування гемагглютинации й ін.);

д) біологічний (зараження тварин, чуттєвих до визначеного типу вірусу);

е) використання ДНК (РНК) зондів (виявлення гібридизації ДНК-ДНК чи РНК-РНК вірусних геномов зі стандартними, джерела яких свідомо відомі, нуклеиновыми кислотами);

ж) полимеразная ланцюгова реакція.

Вірусологічні та серологічні методи доповнюють один іншого та являють собою основу лабораторної діагностики вірусніх інфекцій.

Вірусологічні методи - виділення вірусів із клінічного матеріалу та їх наступна ідентіфікація

Серологічні методи - визначення противірусних антитіл у сироватці крові хворих і тих, хто переніс хворобу (серологічна діагностика), або здорових осіб (визначення показань перед вакцінацією або контроль напруженості поствакцінального імунітету.

Виділення вірусів здійснюють: уразі виникнення нових епідемій та необхідності розшифрування їхньої етіології; для вивчення етіології нових захворювань або подібних до них за клінічними проявами хвороб, що мають різні заподій: якщовиникають труднощі в діференціюванні вірусів за допомогою серологічних тестів. Виділеннявірусів потребує значного години від 2 до 4 тижнів) і великих матеріальних витрат. Факт виділення вірусу з клінічного матеріалу та визначення високих титрів антитіл у сироватці крові хворого ще не означають, що дане захворювання спричинено саме цим збудником.

Серологічні методи діагностики простіші, ніж вірусологічні і швидче виконуються. Разом з тім, смороду потребують наявності в лабораторії збудника вірусної інфекції. Діагностичний приріст антитіл може бути виявлений через 2 – 3 тижні від початку прояву клінічних симптомів захворювання. Томові часто діагноз підтверджується лише в період реконвалесценції.

роцесі репродукції вірусів у живих системах виникають зміни, що дають змогу виявити вірус, визначити якісно і кількісно його інфекційну активність.Для окремих представників кожної родинив вірусів характерні свої специфічні зміни.

В організмі чутливих тварин виникають клінічні симптоми захворювання, відставання в розвитку та зазагибель новонароджених.. В уражених вірусом органаз з'являються характерні гістологічні зміни, наприклад, віруси Коксакі А та Коксакі В.

У курячого ембріона під час розмноження вірусів візуально визначають посилення оболонок ембріона, судинного малюнку, гіперемію, крововиливи, а також появу специфічних утворень у вигляді віспин, бляшок тощо. Наслідком репродукції вірусу є затримка розвитку або зазагибель курячго ембріона.

Індикацію вірусу в культурі клітин зжійснюють за цілою низкою специфічних і неспецифічних змін, що виникають у процесі їх репродукції.

До специфічних змін у культурах клітин належати::

Цитоплазматична дія (ЦПД) – її визначають як комплекс морфологічних змін у процесі взаємодії віруса з клітиною.

Включення, які розглядають як: а) вогнища репродукції вірусу в клітині; б) накопичення вірусних часток або молекул їхнії білків; в) реакцію клітин на присутність у них вірусу.

Включення поділяють, залежно від розташування, на ядерні (віруси герпесу, аденовіруси,поліомавіруси, флавівіруси та ін.), цитоплазматичні (віруси віспи, грипу, розповіді тощо) та мішані. Залежно від чутливості до барвника виділяють базофільні йацидофільні включення. Їх також групують за розмірами, формою, чисельністю тощо.

Бляшкоутворення – здатність вірусів у присутності поживного покриття різного складу до локального розмноження в клітинній культурі з наступним руйнуванням сусідніх клітин і формуванням у клітинному моношарі дефектів – вірусних бляшок. Кожна бляшка формується як результат розмноження однієї вирусної частки, та відповідає одній бляшкотворній одиниці (БТО) інфекційної активності вірусу.

Реакція гемадсорбції – це здатність клітин, інфікованих вірусом, адсорбувати на своїй поверхні еритроцити. Ця реакція характерна для представників батьківщин вірусів, що мають гемаглютинін у складі суперкапсидної оболонки (родини Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae).

Кольорова (або метаболічна) проба, яка відбиває зміни метаболізму клітин у процесі репродукції в них вірусу, що впливає на показники рН культурального середовища.

Інтерференція – передбачає пригнічення цитопатичної дяї одного вірусу під впливом іншого, або дією інтерферонів.

Суперінфікування – поява цитопатичних змін у культурі клітин під впливом іншого вірусу.

Іммунофлюоресценція – специфічне світіння в культурах клітин, інфікованих вірусами, що виникає під дією ультрафіолетового проміння, у разі обробки сироватками, міченими флюорохромами.

У культурах клітин відбуваються такі неспецифічні зміни: проникність плазматичної мембрани, сегментування, локалізація хроматину в ядрі, хромосомні аберації (структурні зміни хромосом), зморщування або пікноз ядра, вакуолізація цитоплазми тощо.

У деяких випадках неспецифічні зміни можуть переходити у специфічні, наприклад, вакуолізуючий вірус SV-40 спричиняє утворення вакуолей у цитоплазмі клітин. Реєстрування таких змін дає підставу твердити про наявність або відсутність вірусу в культурі кліин. Належність вірусу до певного типу аожна встановити лише за допомогою серологічних реакцій.

Титрування виділених вірусів проводять з метою кількісного визначення вмісту вірусних часток в одиниці об’єму досліджуваного матеріалу. Титрування є обов’язковим етапом як виділення вірусів з клінічного матеріалу, так і їх подальщого типізування та визначення біологічних властивостей збудника.

Методи ттрування вірусів з використанням живих систем є різні:

Титрування вірусів у культурах клітин за методами:

а) кінцевого розведення з метою виявлення цитопатичної дії (ЦПД);

б) бляшкоутворення;

в) кольорової проби.

Титрування вірусів, що мають гемаглютинуючу активність, виділених на курячих ембріонах (титр означають у гемаглютинуючих одиницях – ГАО).

Титрування вірусів, виділених з використанням лабораторних тварин передбачає визначення дози, за кмови якої збудник спричиняє загибель 50% інфікованих тварин, або характерні симптоми захворювання (титр ЛД₅₀ - летальна доза або ІД₅₀ - інфікуюча доза.

Реакція гемаглютинації (РГА) та реакція гальмування гемаглютинації (РГГА)

Гемаглютинація – це феномен склеювання еритроцитів унаслідок дії на них різних биологічних агентів, зокрема й вірусів. Гемаглютинуючі властивості виявлені в багатьох вірусів, патогенних для людини. Ці віруси належати до батьківщин Оrthomyxoviridae, Parayxoviridae, Rhabdoviridae, Pоxviridae, Reoviridae, Adenoviridae та ін.

Як правило, гемаглютинуючі властивості збудників вірусних інфекцій забезпечуються їхнім структурним білком, що в простих вірусів (без зовнішньої оболонки) входити до складу капсиду, а у вірусів, які мають суперкапсид, є гліко- або ліпопротеїдом оболонки. Цей білок називають гемаглютиніном. Наявність гемаглютинуючої активності не є показником інфекційних властивостей вірусу.

Наприклад, гемаглютинін вірусу грипу являє собою глікопротеїд, розташований на поверхні вириона у виді численних коротких виступів. Вірус може прикріплюватися до еритроцитів, що володіють комплементарними рецепторами, ормируя тривимірні структури, що складаються з «склеєних» між собою еритроцитів. Можливо, віруси, адсорбовані на поверхні еритроцитів,змінюють їхній заряд, унаслідок чого вірусі набувають здатності чклеюватись, осідаючи на дно пробірки або лунки планшета тонкою плівкою у вигляді перевернутої парасольки (картина повної гемаглютинації).

Гемаглютинация вірусів грипа, парамиксовирусов, ускладнюється тім, що крім гемаглютинина вирионы містять також фермент нейраминидазу, що руйнує гликопротеидные рецептори на поверхні еритроцитів, что приводити до десорбції вірусу з поверхні еритроцита. Якщо реакцію проводити при +4^ос (температурі занадто низкою для дії ферменту, то десорбції не відбувається. Для видимої аглютинації курячих еритроцитів (обычно 0,25 мол 1%-ний суспензії) потрібно близько 10⁷ вирионов вірусу грипу. Отже, реакція гемагглютинации не настільки чуттєва, щоб уловити невеликі кількості вірусу, однак вона дуже проста, что робить її зручної при наявності великих кількостей вірусу.

Таблиця