Методы выделения и идентификации флавоноидов

Для выделения флавоноидов используют различные способы экстракции, например, проводят экстракцию растительного материала этанолом или метанолом, учитывая растворимость агликонов и гликозидов флавоноидов в спирте.

Спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и после охлаждения удаляют неполярные соединения (хлорофилл, жирные и эфирные масла), т.к. при охлаждении они выпадают в осадок, который необходимо отделить.

Часто для отделения сопутствующих веществ сырье сначала обрабатывают хлороформом, т.е. «обезжиривают», а затем уже экстрагируют спиртом разной концентрации. Спиртовое извлечение исследуют. Проводят качественный и количественный анализ.

Флавоноиды из водной фазы извлекаютпоследовательно этиловым эфиром (агликоны), этилацетатом (в основном монозиды) и бутанолом (биозиды, триозиды).

Для разделения компонентов каждой фракции используют колоночную хроматографию на силикагеле, полиамидном сорбенте или целлюлозе.

Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с метиловым спиртом с возрастающей концентрацией метилового спирта, спирто-водными смесями с возрастающей концентрацией спирта, если сорбентом служит полиамид, в случае целлюлозы – 5-30 %-ной уксусной кислотой.

Для выделения отдельных флавоноидов существуют специфические методы.

Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства:

– определение температуры плавления;

– определение удельного вращения гликозидов;

– сравнение УФ, ИК, масс-, ПМР спектров со спектрами известных образцов.

УФ спектр флавоноидов характеризуется наличием, как правило, двух максимумов поглощения.

УФ спектроскопия успешно используется для установления свободных ОН-групп в молекуле флавоноида путем добавления различных реактивов (ацетата натрия, метилата натрия, борной кислоты с ацетатом натрия, хлористого алюминия). При добавлении этих реактивов происходит смещение максимумов поглощения, характерное для гидроксильных групп в различных положениях.

В ИК спектре флавоноидов имеются полосы поглощения, характерные для различных группировок [23].

ü Хроматографические методы идентификации флавоноидов.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Тонкослойная хроматография основана на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое (неподвижная фаза толщиной 0,1-0,5 мм) сорбента при их движении в потоке подвижной фазы (элюента). В качестве сорбентов используют мелкозернистые силикагель, оксид алюминия, целлюлозу, крахмал, полиамид, иониты и другие вещества.

В зависимости от выбора хроматографической системы (состава подвижной и неподвижной фаз) в разделении веществ основную роль могут играть процессы адсорбции, экстракции, ионного обмена, комплексообразования. На практике часто реализуются одновременно несколько механизмов разделения.

В зависимости от положения пластинки и направления потока элюента различают восходящую, нисходящую и горизонтальную ТСХ. По технике работы выделяют фронтальный анализ и обычно используемый элюционный вариант. Применяют также «круговую» (когда анализируемый раствор и растворитель последовательно подаются в центр пластинки) и «антикруговую» ТСХ (когда анализируемый раствор наносится по окружности и элюент перемещается от периферии к центру пластинки), ТСХ под давлением (когда растворитель под давлением пропускают через слой сорбента, покрытый плотно прижатой полиэтиленовой пленкой), а также ТСХ в условиях градиента температуры, состава сорбента и т. п.

Систематизация литературных данных по применению ТСХ для разделения флавоноидных соединений показала, что подавляющее количество исследователей в своей работе применяют в основном пять систем растворителей, состоящих из водных растворов уксусной кислоты и сочетания уксусной кислоты с н -бутанолом, метакрезолом; реже используют этилацетат, насыщенный водой.

Положение хроматографических зон на хроматограмме характеризует величина R_f – отношение пути l_i, пройденного центром зоны i-го компонента от линии старта, к пути l, пройденному элюентом: R_f = l_i/l; R_f ≤ 1. Величина R_f зависит от коэффициентов распределения (адсорбции) и от соотношения объемов подвижной и неподвижной фаз.

Е. Бейт-Смит и Р. Уэстолл при сопоставлении строения флавоноидов и велечин R_f в пяти системах вывели ряд правил, устанавливающих зависимость между строением и хроматографическим поведением флавоноидов:

– R_f снижается при увеличении количества гидроксильных групп в молекуле;

– метилирование гидроксильных групп приводит к повышению R_f, так как величина групповой константы (R_m) для метоксильной группы значительно ниже, чем для гидроксильной;

– ацетилирование может способствовать как повышению, так и понижению R_f;

– глюкозидирование обусловливает снижение R_f на величину, равную введению одной гидроксильной группы. Наличие двух сахарных компонентов в различных положения дигликозидов снижает R_f больше, чем у биозидов.

Орто- и вициальные положения заместителей приводят к исключению из данных правил в сторону увеличения R_f.

Идентификацию флавоноидных соединений, за исключением флаванонов и флаванонолов, не имеющих собственной окраски, можно проводить без обработки хроматограмм, однако для увеличения чувствительности и повышения избирательности методик хроматографического анализа используют реактивы, способные образовывать окрашенные соединения и флуоресцировать в УФ-свете: 1 %-й раствор хлорного железа в спирте или 2 %-й водный раствор; 2 %-й раствор хлористого цирконила в метиловом спирте; 1 %-й водный раствор ацетата свинца, 1 %-й спиртовой раствор хлористого алюминия и др. [16].

Гель-хроматография. В этом варианте хроматографии молекулы фрак-ционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул, – точно такой же, как жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы.

Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее затруднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвижной фазы, оказывается недоступной для молекул вещества, растворенного в подвижной фазе.

Правильный размер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения.

Первоначально в качестве пространственной сетки использовали полимерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем.

Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зависеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма молекулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.

Как и во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика [25].

Газожидкостная хроматография. Преимущество газожидкостной хрома-тографии заключается в возможности определения качественного состава и количественного содержания разделенных компонентов, а также автоматизации процесса контроля.

При качественной характеристике используют величину относительно времени удерживания (t_отн), приняв за стандарт одно из хроматографируемых веществ. Однако проведение анализа без получения метиловых или триметил-силильных эфиров невозможно [26]. Рядом исследователей показана возможность идентификации флавоноидов на колонке с 1,5 % неподвижной фазы SE-30 на хромосорбе W (60-80 меш) и 12 % диэтилгликольсукцината на газ-хроме Р (800-100 меш). Среди исследуемых флавонов, флавонолов, флаванонов, флаванонолов, халконов и изофлавонов наиболее длинные t_отн имеют флавонолы. Отмечено, что количество гидроксильных групп увеличивает t_отн. При равных количествах гидроксильных групп у флаванонов большие величины t_отн имеют вещества с гидроксильными группами в ортоположениях по сравнению с соединениями, имеющими оксигруппы в метаположении. При равном количестве гидроксильных групп (три) в кольцах А и В t_отн больше у соединений с тремя гидроксилами в кольце А. Размыкание лактонного кольца увеличивает время удерживания [16].

ü Методы анализа флавоноидов.

Флавоноиды являются типичными представителями соединений, имеющих в своих молекулах одноименные группы; С=О, –ОН, С=С, а также основные фрагменты молекул. Наличие в молекулах общих и специфических групп обуславливает проявление этими соединениями общих физико-химических свойств, а именно: слабо выраженных кислотных свойств, способности вступать в реакции комплексообразования, окисления, восстановления, присоединения, сочетания, замещения, люминесцировать и поглощать при различных длинах волн.

Оптические методы. Количественное определение исследуемых соединений в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения является одним из наиболее распространенных методов анализа. При этом рабочими диапазонами длин волн служат длинноволновые максимумы для флавоноидов – 330-370 нм.

Спектрофотометрические определения по реакции диазотирования ранее были широко распространены. Реакция чувствительна, но не избирательна, так как наряду с флавоноидами эту реакцию дают фенольные соединения, пиразолоны и другие классы соединений. Применение данного метода ограничено его неспецифичностью из-за прохождения реакции у флавоноидов только по кольцу А при наличии свободного ортоположения по отношению к фенольному гидроксилу у 7-го углеродного атома. Поэтому даже суммарные определения с данным реактивом не показывают истинного содержания исследуемых веществ как в суммарных фитохимических препаратах, так и в растительном сырье.

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения флавоноидов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотно-кислым галлием. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотно-кислым галлием. Описаны методики анализа флавонолов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм, а также цинком и мышьяком [27].

Комплексообразующие свойства флавоноидов положены в основу и флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствии-тельным, чем спектрофотометрический, но не лишенного перечисленных не-достатков последнего метода.

Широко распространена при определении общего количества флавоноидных соединений флавонов, флавонолов, халконов в растениях методика фотометрии-ческого определения по реакции комплексообразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексообразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений [28].

В ряду спектрофотометрических методов анализа флавоноидов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0,5-1мкг/мл при длинах волн 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизво-димости результатов.

Полярографические методы. Восстановление флавоноидов на ртутном капельном электроде (РКЭ) положено в основу высокочувствительного полярогра-фического метода их анализа. Метод позволяет анализировать сумму флавоноидов в пересчете на одно из соединений класса, выбранное в качестве стандарта. В отличие от спектрофотометрии окрашенных комплексов метод дает более близкие к истинному суммарному содержанию результаты.

Флавоноиды(флавонолы) могут быть определены на фоне 0,4 М раствора хлористого алюминия при потенциале полуволны 1,5 В. Метод заслуживает внимания и особенно незаменим в научно-исследовательских разработках, так как позволяет установить наличие внутримолекулярных связей [29], проводить идентификацию по величине потенциала полуволны, оценивать реакционную способность отдельных групп в молекуле [30]. В практике фармацевтического анализа и в особенности в заводских условиях полярографический анализ встречает затруднения, так как требует соблюдения строгих условий техники безопасности при работе со ртутью. К недостаткам метода можно отнести его малую избирательность (из-за близких величин потенциалов полуволн) по отношению к исследуемым классам соединений, в связи с чем требуется, как и при спектральных методах, предварительное разделение веществ.

Таким образом, из рассмотренных методик анализа ни одна не может быть применена для количественного определения каждого из исследуемых классов веществ в растительном сырье и суммарных препаратах без предварительного разделения. Этих недостатков лишены методы газожидкостной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) под давлением, позво-ляющие решать вопросы идентификации и количественной оценки веществ в микроконцентрациях.

Комбинированные методы. В настоящее время широкое распространение в анализе получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим опреде-лением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определением площади пятна на хроматограмме.

Комбинированные методы позволяют получить исчерпывающий ответ на вопрос о содержании каждого биологически активного вещества или суммы веществ одного класса, устранив возможные ошибки, связанные с влиянием других групп или классов соединений, находящихся в сырье или лекарственных препаратах.

Решение вопроса анализа каждого из веществ или суммы веществ, относящихся к одному классу соединений, в ряду исследуемых соединений крайне необходимо, так как флавоноиды, антрахиноны и производные кумарина, исходя из путей биосинтеза, могут совместно присутствовать в растительном сырье.

Из комбинированных методов количественного определения на первом месте по числу публикаций стоит хроматооптический метод. Он имеет несколько разновидностей, а именно: определение оптической плотности, или люминесцен-ции, в элюатах из пятен хроматограмм, сканирование оптической плотности или люминесценции, непосредственно на хроматограммах.

Для определения оптической плотности в элюатах из пятен хроматограмм применяют фотоколориметрическиое, спектрофотометрическое и флуорометри-ческое определения. Инфракрасная спектрофотометрия применена в большинстве случаев лишь для качественных определений.

Так, анализ флавоноидных соединений в растительном сырье в настоящее время проводится в основном хроматооптическими методами. Оптическая плотность измеряется после добавления к элюату раствора хлористого алюминия при длине волны – 315 нм. Без добавления хлористого алюминия оптическую плотность определяют при 354 и 315 нм соответственно для кверцетина и дигидрокверцетина [16].

Проводя итоги обзора литературы по физико-химическим свойствам, методам идентификации и анализа флавоноидов можно сделать вывод, что в настоящее время наиболее доступными, чувствительными и быстрыми методами контроля биологически активных соединений в растительном сырье и препаратах являются хроматографические методы: тонкослойной и гель-хроматографии.

В исследовании применяется ТСХ в элюционном варианте для разделения и анализа флаваноидов. Достоинства данного метода: простота, экономичность, доступность оборудования, экспрессность (продолжительность разделения 10-100 мин), высокие производительность и эффективность разделения, наглядность результатов разделения, простота обнаружения хроматографических зон.

Метод гель-хроматографии прост в исполнении, проводится в мягких условиях, а также обладает высокой производительностью и эффективностью разделения.

Целью нашей работы является определение содержания флавоноидов в технологическом отходе, который образуется при производстве настойки пустырника.

Изм.

Лист

№ докум.

Подп.

Дата

Лист

БГТУ 04.00.ПЗ

Разраб.

Бут-Гусаим

Пров.

Флюрик

Консульт.

Н. контр.

Флюрик

Утв.

Технологическая часть

Лит.

Листов

БГТУ 3141512,2012

4 Технологическая часть