I. Теоретическая часть. Для определения активности фагоцитарных клеток используют ряд реакций, основанных на контроле разных этапов фагоцитоза

Для определения активности фагоцитарных клеток используют ряд реакций, основанных на контроле разных этапов фагоцитоза, а также оценке основного эффекта фагоцитарной реакции, а именно – определение численности клеток, способных к фагоцитозу и количества поглощенных объектов фагоцитоза.

В основе определения фагоцитарной активности фагоцитов – биологический метод, предполагающий воспроизведение фагоцитоза в условиях in vitro путём смешивания суспензии клеток-фагоцитов и объектов фагоцитоза. После инкубации этой суспензии (время определяется конкретными условиями и особенностями фагоцитов) осуществляется регистрация результатов.

Общая схема исследования фагоцитоза

Выбор клеток-фагоцитов. Как известно, клетками-фагоцитами являются нейтрофилы и макрофаги. Поскольку для макрофагов характерна тканевая локализация, то использование их в качестве клеток-фагоцитов в условиях in vitro не представляется возможным. Поэтому основной популяцией фагоцитов, используемых для научных исследований и для иммунодиагностики, являются нейтрофилы периферической крови.

Условия получения клеток-фагоцитов. Обычно для изучения фагоцитоза используют гепаринизированную венозную или капиллярную кровь, но удобнее работать с лейкоцитарной взвесью. При необходимости используют фракционирование лейкоцитов (или периферической крови) для получения чистой суспензии нейтрофилов.

Выбор объекта фагоцитоза. В качестве тест-объекта для изучения фагоцитоза могут использоваться как суспензия микроорганизмов (Staphylococcus aureus или Е. coli) так и частицы латекса диаметром 3 мкм. В последнем случае недостатком является невозможность определения параметров завершенности фагоцитоза (т. е. уничтожения и деструкции объекта фагоцитоза).

Условия приготовления объекта фагоцитоза. Со скошенного питательного агара, на котором растет культура S.aureus или Е. coli (суточная) физиологическим раствором смывают колонии микробов. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов связаны с концентрацией объекта фагоцитоза, т. е. с концентрацией микробной суспензии или суспензии частиц латекса, поэтому для стандартизации проводимых исследований нужно использовать одинаковую концентрацию объектов фагоцитоза. Соотношение нейтрофилы: микробы должно составлять 1:100. Доведение суспензии микробов до необходимой (1´10⁹/мл) концентрации проводят с помощью оптического стандарта мутности.

Стандарт мутности представляет собой ампулированный препарат, содержащий суспензию инертных частиц диаметром 1–2 мкм в определенной концентрации (выпускаются стандарты мутности на 1´10⁶ частиц в мл, 1´10⁹ частиц в мл и др.). При доведении концентрации микробной суспензии до желаемого уровня проводят визуальное сравнение мутности стандарта с суспензией микробов, помещенных в пробирку такого же диаметра, что и ампула стандарта мутности (рис. 2.1, справа).

Рисунок 2.1 Сравнение смыва бактериальной культуры со скошенного агара (слева) со стандартом мутности (справа)

При видимом превышении концентрации микробной суспензии (см. рис. 2.1) ее разводят физиологическим раствором. Основным недостатком данного подхода является субъективность учета, поэтому более приемлемым вариантом является автоматизированное определение концентрации микробной суспензии с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК).

Иногда, в связи с вирулентностью микроорганизмов, их инактивируют обработкой формалином. Для этого суспензию микроорганизмов смешивают с равным объемом 5%-го формалина, инкубируют в течение 5 минут, затем отмывают 3 раза и доводят до необходимой концентрации.