Процедура разделения крови на фракции клеток на градиенте плотности фиколл-верографин

Градиент плотности – это раствор определенного вещества, имеющего при разной концентрации разную плотность, которая может быть измерена специальным прибором – ареометром, и способные обеспечить оптимальные для клеток условия осмотичности среды.

Градиенты плотности широко применяются в разных областях медико-биологических наук. Так, в биохимии для выделения митохондрий и др. субклеточных органелл применяют градиент из раствора сахарозы, в вирусологии для выделения вирионов – из растворов солей кремния или цезия. В иммунологии наиболее широко применяют растительный полисахарид – фиколл, дополняемый рентгенокотрастным препаратом верографином (визотрастом и проч.), а также растворы перколла (частицы кремния диаметром 15–30 нм, покрытые поливинил-пирролидоном). Многие фирмы выпускают готовые градиенты плотности с заданными свойствами, либо их можно приготовить из отдельных ингредиентов. При этом рассчитывают необходимое количество порошка градиента, растворяют его в дистиллированной воде, проверяют плотность и при необходимости стерилизуют.

Метод выделения мононуклеаров основан на разной плавучести различных форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности (таблица 1.2) позволяет отделить мононуклеары (лимфоциты, моноциты, бластные клетки) от эритроцитов и гранулоцитов.

Таблица 1.2

Используемые градиенты плотности при выделении клеток человека

(Cell separation methods and applications, edited by D.Recktenwald, 1997)

Тип клеток	Плотность градиента, г/см3
Лимфоциты (Т- и В-)	1,077
Моноциты	1,064
Гранулоциты	1,093
NK-лимфоциты	1,06
Эритроциты	1,115

В результате центрифугирования суспензии клеток на градиенте плотности, происходит разделение клеток на фракции, схематично представленное на рис. 1.12.

Рисунок 1.12 Седиментация клеток периферической крови при центрифугировании на градиенте плотности 1,077 г/см³

Разделение клеток крови на градиенте плотности приводит к тому, что каждый тип клеток находится на том или ином месте градиента, откуда нужные клетки можно изъять пастеровской пипеткой или обычным дозатором в отдельную пробирку.

В большинстве ситуаций выделенные клетки требуют процедуры отмывания для избавления от примесей в виде обломков клеток и ненужных веществ (белки плазмы крови, вещество градиента). После отмывания определяют концентрацию клеток. При необходимости изучают морфологию клеток для понимания степени гомогенности выделенной клеточной популяции.