I. Теоретическая часть

Проведение любых лабораторных процедур предполагает использование специального оснащения, включая лабораторную посуду, лабораторный инструментарий и лабораторное оборудование.

В иммунологических лабораториях использую широкий спектр лабораторной посуды.

Для отбора, хранения, центрифугирования биологических образцов, а также проведения иммунологических и биохимических реакций используются:

А) стеклянные или пластиковые пробирки объемом от 5 до 15 мл (рис. 1.1). Пробирки могут быть с круглым или плоским дном, круглого диаметра или конические по форме, иметь специальные крышки. Каждый вид таких пробирок имеет специальные характеристики, требуемые особенностями протокола выполняемой реакции или исследования. Например, при работе с клетками применяют пробирки из материалов, предотвращающих адгезию клеток, либо обрабатывают стеклянные пробирки силиконом. Все пробирки устанавливают в штатив, подходящего размера и с определённым количеством мест для пробирок (рис. 1.2).

Данные виды пробирок широко применяются для забора первичных биологических образцов жидкости (кровь, лимфа), используются для всех видов иммунологического анализа, пригодны для хранения проб при пониженных температурах, пригодны для кипячения и автоклавирования, используются для центрифугирования;

Б) пластиковые или стеклянные пробирки для микроанализа объемом от 0,5 до 2 мл. Пробирки этого типа могут быть с круглым, плоским или остроконечным дном и иметь специальные крышки (рис. 1.3). Эти пробирки применяются для всех видов иммунологического анализа, для хранения проб при пониженных и отрицательных температурах. Их можно подвергать автоклавированию (для стерилизации), помещённый в них биологический материал можно центрифугировать в специальных центрифугах;

В) полистироловые планшеты для микроанализа с круглодонными или плоскодонными лунками (рис. 1.4). Объем лунок составляет 250–300 мкл, планшеты изготавливаются из специального полистирола, обладающего повышенной адсорбционной способностью для фиксирования на поверхности лунок клеток или белковых компонентов иммунохимических систем. Стандартный полистироловый планшет состоит из 96 лунок, расположенных горизонтальными рядами. Лунки имеют буквенную и цифровую нумерацию по горизонтали и вертикали соответственно. Полистироловые планшеты используются для проведения иммунохимического анализа (например, ИФА), а также для клеточных иммунологических тестов.

Кроме 96-луночных планшетов применяют и стрипы. Они представляют собой вариант полистиролового планшета, в котором каждый ряд ячеек фиксируется отдельно на планшетной рамке и анализ может проводиться в небольшом количестве лунок.

Для точного дозирования объемов биологических жидкостей, химических реактивов и компонентов иммунологических тест систем используются:

А) пипетки мерные стеклянные на полный слив предназначены для отмеривания точного объема жидкости, верхняя отметка соответствует номинальной вместимости, прямые и с расширением. Минимальный точно отмеряемый объем – в пределах 1 мл (рис. 1.5, слева). Пипетки мерные пластиковые с расширением и без также предназначены для точной дозировки компонентов реакционной смеси (рис. 1.5, справа). Минимальный точно отмеряемый объем – в пределах 1 мл.

Б) для точного дозирования малых (и не только) объемов используются полуавтоматические и автоматические дозирующие устройства – пипетки с фиксированным или переменным объемом (рис. 1.6). Минимальный точно отмеряемый объем – в пределах 1 мкл.

Данные пипетки могут быть одно- и многоканальными, а также иметь электронный блок управления. Пипетки (дозаторы) снабжаются сменными полистироловыми наконечниками.

При работе с автоматической пипеткой необходимо соблюдать следующие правила:

- пластиковый наконечник необходимо плотно зафиксировать на держателе автоматической пипетки;

- во время работы пипетка должна находиться постоянно в вертикальном положении;

- после набора жидкости в наконечник автоматической пипетки категорически запрещается переводить пипетку в горизонтальное положение или оставлять ее на столе;

- при внесении первого компонента иммунохимической реакции в пробирку или в лунку полистиролового планшета наконечник пипетки должен касаться дна пробирки или лунки;

- при внесении каждого последующего компонента иммунохимической реакции в пробирку или в лунку полистиролового планшета наконечник пипетки должен касаться стенки пробирки или лунки над поверхностью жидкости;

- освобождение жидкости из пипетки осуществляется плавным нажатием на поршень до ощутимого упора.

Иммунологические методы исследования являются составной частью общелабораторного дела. Проведение иммунологических методов исследования предполагает владение и использование таких процедур, как взвешивание на разных видах весов, приготовление растворов, расчёт концентраций и массовых объёмов при приготовлении растворов, определение рН растворов, доведение рН приготовленного раствора до необходимого уровня, центрифугирование и многое другое.

Но, кроме общелабораторных, в области иммунологии применяются и специализированные процедуры, без освоения которых невозможно проведение ни одного метода и методики иммунологического исследования.

Эти процедуры охватывают этапы предварительной подготовки исследуемого материала собственно к исследованию и промежуточные процедуры.

Для иммунологического исследования чаще всего используется периферическая кровь. Кроме неё иммунологическому исследованию могут подвергаться самые разные секреты и экскреты организма человека, биоптаты из разных тканей, отделяемое из ран. Но по приемлемости и уровню информативности полученных результатов исследование крови занимает первую позицию.

При иммунологическом исследовании крови изучению подвергают как клетки, так и молекулы, то есть исследуют отдельно клеточную часть крови и её гуморальную фракцию.

Для обеспечения возможности исследования клеточной части крови и её гуморальной фракции взятие крови осуществляют в 2 пробирки: в сухую, стерильную и химически чистую пробирку помещают порцию крови, которая предназначается для получения сыворотки крови. В стерильную, химически чистую пробирку с антикоагулянтом (гепарином, калиевой или натриевой солью ЭДТА) помещают порцию крови, которая не свернётся, и клетки останутся доступными для исследования.

Обычно для иммунологического исследования у человека забирают 10 мл крови: 5 мл для получения сыворотки крови и 5 мл для возможности исследования клеток. Объём забираемой крови может быть увеличен, но нужно помнить о том, что кроме иммунологического исследования, обследуемый человек нуждается и в других анализах, которые также проводятся с использованием крови.

Кровь для исследования забирается путём пункции локтевой вены, обычно натощак, утром. При необходимости кровь для иммунологического исследования забирается и в другое время суток.

Полученную кровь (2 пробирки – для получения сыворотки крови и для исследования клеток) подвергают процедурам предварительной обработки (предобработки):

1) кровь инкубируют для последующего отделения сыворотки крови;

2) в образце крови определяют количество лейкоцитов и лейкоцитарную формулу. Эта информация необходима для дальнейших исследований, она составляет предмет обычного гематологического анализа (или анализа крови), но может быть проведена и самостоятельно в рамках предподготовки образца крови для иммунологического исследования. В этом случае речь идёт об определении концентрации клеток (например, лимфоцитов или нейтрофилов) в подготавливаемой к исследованию суспензии и об определении клеточного состава образца суспензии по морфологии клеток;

3) образец крови с антикоагулянтом подвергают разделению на фракции на градиенте плотности или другим способом.