Определение патологических компонентов мочи

Задание 1. Провести качественные реакции на белок в моче.

Ход работы. А) Проба кипячением: заранее проверяют мочу по лакмусу. Если моча имеет кислую реакцию, то её (2-3 мл) сразу кипятят в пробирке; если моча имеет щелочную реакцию, то её сначала подкисляют по лакмусу, прибавляя по каплям 1% раствор уксусной кислоты. В присутствии белка при кипячении образуется помутнение или осадок коагулированных белков, который не растворяется при повторном кипячении после добавления к жидкости 3-5 капель 10% уксусной кислоты. Б) Осаждение белка концентрированной нитратной кислотой (проба Геллера): в пробирку наливают около 1 мл концентрированной нитратной кислоты и осторожно из пипетки по стенке пробирки наливают мочу. В присутствии белка на границе жидкостей образуется белый аморфный слой или помутнение, так называемое белковое кольцо. При отсутствии белка в моче на границе двух жидкостей появляется цветное прозрачное кольцо, обусловленное изменением пигментов мочи под влиянием нитратной кислоты. В) Осаждение белка сульфосалициловой кислотой: к 1-2 мл мочи прибавляют 2-3 капли свежеприготовленного 20% раствора сульфосалициловой кислоты. При наличии белка в моче образуется белый осадок или помутнение.

Задание 2. Провести количественное определение белка в моче по методу Брандберга-Стольникова.

Принцип. Метод базируется на экспериментально установленном факте, что появление едва заметного белкового кольца при пробе Геллера имеет место между второй и третьей минутами при концентрации в моче 0,0033% белка, т.е. 0,033 г/л. Последовательно разводя мочу и наслаивая её на нитратную кислоту, достигают такого максимального разведения мочи, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Перемножают разведение на 0,033 г/л и получают содержание белка в моче.

Ход работы. Проводят пробу Геллера с нормальной и патологической мочой, для чего вносят в пробирку 20 капель концентрированной нитратной кислоты и осторожно из пипетки наслаивают мочу. Если в моче содержится белок, то через 2-3 мин образуется белое помутнение в виде кольца. Мочу с положительной пробой Геллера используют для количественного определения белка, для чего готовят разведение мочи. В пять пробирок наливают по 2 мл дистиллированной воды. В первую вносят 2 мл мочи, перемешивают и отбирают 2 мл смеси, переносят в другую и т.д. Из последней пробирки 2 мл набранной жидкости отбрасывают. Получают мочу, разбавленную в 2, 4, 8, 16, 32 раза. В другие пять пробирок отмеривают по 2 мл концентрированной нитратной кислоты и осторожно с помощью пипетки наслаивают на кислоту соответствующую пробу разбавленной мочи. Отмечают максимальное разведение мочи, при котором появляется мутное белое кольцо между второй и третьей минутами. Найденное разведение мочи умножают на 0,033 г/л. Например, кольцо денатурированного белка образовалось в четвертой пробирке, где разведение равняется 16. Тогда, содержание белка в опытной моче 0,033х16=0,548 г/л.

Клинико-диагностическое значение. Белок появляется в моче при гломерулонефрите (т.е. воспалении клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость), в случае сердечной недостаточности, иногда при беременности.

Задание 3. Определить глюкозу в моче (см. модуль 3, занятие 4 «Методические указания для самостоятельной подготовки студентов медицинских факультетов к практическим занятиям по биологической химии», часть 1).

Клинико-диагностическое значение работы. В моче здорового человека глюкоза содержится в незначительном количестве (не выше 0,4 г/л) и не может быть выявлена обычными химическими реакциями. Значительное выделение глюкозы с мочой наблюдается при нарушении гормональной регуляции углеводного обмена, заболеваниях панкреати-ческой железы и нарушении реабсорбционной способности почек. Почеч-ную глюкозурию наблюдают при введении в организм большого количества алкоголя, наркотиков, адреналина, хлороформа и других веществ.

Задание 4. Провести качественные реакции на ацетоновые тела (см. модуль 3, занятие 9 «Методические указания для самостоятельной подготовки студентов медицинских факультетов к практическим занятиям по биологической химии», часть 1).

Клинико-диагностическое значение. В нормальной моче кетоновые вещества (тела) встречаются в незначительном количестве (не больше 0,01 г/сут) и не выявляются качественными реакциями; эти реакции являются положительными лишь при выведении большого количества кетоновых тел при сахарном диабете, голодании, исключении углеводов из пищи; кетонурия может наблюдаться при заболеваниях, связанных с усиленной затратой углеводов (тиреотоксикоз), кровоизлияниях, черепно-мозговых травмах, инфекционных заболеваниях (скарлатина, грипп, туберкулез, менингит). В раннем детском возрасте острые заболевания пищеварительного тракта (дизентерия, энтероколит), продолжительная гипертермия могут сопровождаться кетонемией и кетонурией вследствие голодания и истощения.

Задание 5. Провести качественные реакции на кровь в моче.

Ход работы. А) проба кипячением с щелочью: наливают в пробирку 4-5 мл нефильтрованной мочи, прибавляют 5-6 капель раствора щелочи и кипятят. Образуется осадок фосфатов. В присутствии кровяного пигмента осадок, который отстоялся, темнее мочи; в отсутствии кровяного пигмента осадок фосфатов будет светлее, чем моча. Б) Бензидиновая проба: базируется на окислении бензидина атомарным оксигеном, который образуется при разложении гидроген пероксида кровяным пигментом – гемоглобином, вследствие его пероксидазного действия. В одну пробирку вносят 5 капель нормальной мочи, в другую - патологической и прибавляют по 3 капли 1% раствора бензидина в 32% уксусной кислоте и 3% раствора гидроген пероксида. При наличии кровяных пигментов моча окрашивается в синий или сине-зеленый цвет.

Клинико-диагностическое значение. Появление крови в моче называется гематурией, наличие кровяных пигментов - гемоглобинурией. Гематурия имеет место при повреждении мочевыводящих путей, мочекаменной болезни, онкологических заболеваниях мочевого пузыря, цистите. Гемоглобинурия наблюдается главным образом при отравлении гемолитическими ядами и ряде заболеваний, связанных с гемолизом эритроцитов.

Задание 6. Провести качественные реакции на жёлчные пигменты в моче.

Ход работы. А) Реакция Гмелина: в пробирку вносят 2-3 мл концентрированной нитратной кислоты и осторожно по стенке прибавляют 1-2 мл мочи (свободной от белка). Доказательством наличия жёлчных пигментов в моче является появление зелёного кольца на границе раздела жидкостей. Б) Реакция Розина: в пробирку вносят 2-3 мл мочи и осторожно наслаивают на нее 1% раствор йода в спирте. При наличии жёлчных пигментов на границе двух жидкостей образуется зелёное кольцо.

Клинико-диагностическое значение. Жёлчные пигменты образуются из гемоглобина при распаде эритроцитов. Основная масса продуктов восстановления билирубина выделяется с калом в виде стеркобилиногена, который окисляется в пигмент стеркобилин. Однако часть стеркобилиногена всасывается в кровь в системе геморроидальных вен и выделяется с мочой. Появление в моче другого продукта восстановления билирубина – уробилиногена является важным показателем недостаточности функции печени. При нарушении функции печени, а также при некоторых инфекционных заболеваниях содержание уробилиногена в моче может составлять до 2 г в сутки. Жёлчные пигменты (биливердин, билирубин и др.) появляются в моче в виде щелочных солей при желтухе.

Задание 7. Провести качественную реакцию на индикан в моче.

Принцип. При действии на мочу концентрированной хлорной кислоты индикан гидролизуется и превращается в индоксил, который окисляется в присутствии FeCI₃ в синее индиго.

Ход работы. В пробирку вносят 3-5 мл мочи и для осаждения веществ, которые мешают определению индиго, прибавляют 1-2 мл 20% раствора уксуснокислого свинца. Фильтруют. К 2-3 мл фильтрата прибавляют такой же объем реактива Обермейера (раствор FeCl₃ в хлорной кислоте), оставляют стоять до появления бурой окраски; затем прибавляют 1-2 мл хлороформа и энергично встряхивают. Индиго растворяется в хлороформе и придаёт ему сине-фиолетовое окрашивание.

Клинико-диагностическое значение. Индикан в нормальной моче человека содержится в очень небольшом количестве (в сутки выделяется около 0,01-0,04 г). При некоторых патологических процессах (запорах, непроходимости кишечника, туберкулезе, перитоните) и употреблении большого количества мясной пищи содержание индикана увеличивается.

Задание 8. Определить патологические компоненты мочи с помощью комбинированных тест-полосок. Комбинированными тест-полосками можно определить в моче шесть важных показателей: рН, белок, глюкозу, кетоновые тела, уробилиноген и кровь.

Ход работы. Берут нецентрифугированную мочу, хорошо перемешивают. Всю тест-полоску погружают в сосуд с мочой на 1 с. Излишек мочи удаляют с полоски, дотрагиваясь стенок сосуда. Через 30-60 с окраску сравнивают со стандартной шкалой. Изменение окраски, которое появилось только по краю индикаторной зоны или только через 2 мин, не имеет диагностического значения. Моча не должна перед исследованием стоять больше 4 ч при комнатной температуре.

Белок. При наличии белка наблюдают изменение цвета тест-полоски от жёлтого до зелёного (0,3; 1,0; 5,0 г/л); патологическая протеинурия наблюдается при уровне белка, который превышает 0,25 г/л. Глюкоза. Положительная реакция от оранжевого до коричневого цвета отмечается через 60 с (5,55; 16,65; 55,55 ммоль/л). Окрашивание появляется даже при небольшом количестве глюкозы (2,2 ммоль/л). Ацетоновые тела. Положительная реакция от розового до фиолетового цвета (+, ++, +++). Чувствительность тест-полоски к ацетоуксусной кислоте выше, чем к ацетону; на β-гидроксимасляную кислоту тест-полоска не реагирует. Граница выявления: 100 мг/л для ацетоуксусной кислоты и от 400 мг/л для ацетона. Уробилиноген. Положительная реакция от розового до красного цвета (граница выявления 4 мг/л). Кровь. Для эритроцитов и гемоглобина предоставляется отдельная шкала. Интактные эритроциты определяются в виде отдельных или густо расположенных зелёных точек на жёлтом фоне (5-10, 50, 250 эрит/мкл). Равномерная зелёная окраска означает присутствие свободного гемоглобина или гемолизированных эритроцитов, или миоглобина (50, 250 эрит/мкл). При малых примесях крови в моче или при более продолжительном смачивании полосок реакция может наступить уже через 1-2 мин.

Ошибочные результаты получают после приёма большого количества витамина С и некоторых медикаментов.

Оформление работы. Выполненную работу оформить в виде таблицы.

Патологические компоненты мочи

Возможные причины появления

Качественная реакция

Наблюдаемый эффект

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 559.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 594-604.

3. Вороніна Л.М. та ін. Біологічна хімія. – Харків: Основа, 2000. – С. 544-545.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 622-624.

5. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./ За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 263-275.

6. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: Навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Х.: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 330-344.

ЗАНЯТИЕ 9

Тема: Биохимия печени. Биотрансформация ксенобиотиков и эндогенных токсинов.

Актуальность. Печень занимает центральное место в обмене веществ организма. Особенности ферментативного аппарата печени и анатомических связей с другими органами предоставляют ей возможность принимать участие в регуляции практически всех путей обмена веществ и обеспечивать динамическое постоянство содержания многих жизненно важных компонентов в организме. Биохимические процессы в печени, с одной стороны, нацелены на образование разных веществ для других органов, а с другой - на обеспечение защиты этих органов от эндо- и экзогенных токсичных веществ. При поражениях печени происходит дезинтеграция обмена веществ в организме, снижение его адаптивных свойств.

Цель. Ознакомиться с особенностями химического состава печени, основными биохимическими функциями и их нарушением при патологических состояниях; ролью в обмене углеводов, липидов, белков, пигментов; процессами биотрансформации ксенобиотиков, микросомальным окислением. Ознакомиться с тимоловой пробой и её клинико-диагностическим значением. Объяснить способ оценки детоксикационной функции печени по образованию гиппуровой кислоты и определению аланин- р -гидроксилазной активности микросом печени.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Биохимические функции печени в организме.

2. Роль печени в обмене углеводов.

3. Роль печени в обмене липидов.

4. Роль печени в обмене белков.

5. Роль печени в пигментном обмене.

6. Жёлчеобразующая функция печени. Химический состав жёлчи.

7. Детоксикационная функция печени. Типы реакций биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных токсинов.

8. Системы конъюгации в печени для обезвреживания токсичных веществ.

9. Нарушение функций печени при заболеваниях. Печёночные пробы.

10. Ксенобиотики: понятие, принципы классификации, пути поступления в организм, транспорт через клеточные мембраны.

11. Микросомальное окисление. Характеристика микросомальных монооксигеназных цепей.

12. Цитохром Р-450 и b₅: особенности структуры, механизм действия при гидроксилировании. Генетический полиморфизм и регуляция синтеза цитохрома Р-450: (индукторы и ингибиторы).

13. Типы конъюгации ксенобиотиков в гепатоцитах: биохимические механизмы, функциональное значение.

14. Пути выведения продуктов биотрансформации ксенобиотиков из организма.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. В печени больного нарушена детоксикация естественных метаболитов и ксенобиотиков. Снижение активности какого хромопротеина может быть причиной этого?

А. Цитохрома в. В. Гемоглобина.

С. Цитохромооксидазы. D. Цитохрома Р-450.

Е. Цитохрома с1.

2. У пациента выявлена жировая дистрофия печени. Нарушение синтеза какого вещества в печени может привести к данной патологии?

А. Холевой кислоты. В. Мочевины.

С. Фосфатидной кислоты. D. Тристеарилглицерина.

Е. Фосфатидилхо- лина.

3. Одной из функций печени является синтез и секреция жёлчи, в состав которой входят жёлчные кислоты, жёлчные пигменты, холестерол, конечные продукты обмена. Какие из приведенных пигментов относятся к жёлчным?

А. Стеркобилин. В. Мелатонин.

С. Гемоглобин. D. Билирубин.

Е. Миоглобин.

4. В реанимационное отделение госпитализирован мужчина, 53 года, в состоянии печёночной комы. В комплекс интенсивной терапии включен аргинин, который активирует:

А. Синтез мочевины. В. Синтез глюкозы.

С. Синтез белка. D. Обезвреживание скатола.

Е. Синтез холе- стерола.

5. Микросомальное окисление - это реакции:

А. Использования кислорода с биоэнергетической целью.

Б. Использования кислорода в пластических процессах.

С. Распад жирных кислот в организме.

D. Распад аминокислот.

Е. Аэробный распад углеводов.

6. У полной женщины, 52 года, наблюдается цирроз печени. Лабораторно выявлена гипоальбуминемия, гиперглобулинемия, визуально - отёки рук, век, ног. Наиболее вероятной причиной отёков является нарушение:

А. Кислотно-щелочного состояния. В. Обезвреживающей функции печени. С. Синтеза гликогена в печени.

D. Синтеза альбуминов в печени. Е. Синтеза липопротеинов в печени.

7. Печень секретирует в кровь синтезированные жиры в составе:

А. ЛПОНП. В. ЛПНП.

С. ЛПВП. D. Хиломикронов.

Е. В свободном виде.

8. Поражение печени (гепатит, цирроз, опухоль) приводит ко всем перечисленным нарушениям белкового обмена, кроме:

А. Гипоальбуминемии. В. Геморрагий.

С. Гипераминоацидемии. D. Азотемии.

Е. Гипер-α-глобули-немии.

9. Какое соединение принимает участие в конъюгации билирубина в гепатоцитах?

А. Глюкоза. В. Фруктоза.

С. Глюконовая кислота. D. Глюкуроновая кислота.

Е. Глицин.

10. Печень является центральным регулятором уровня глюкозы в крови благодаря наличию в гепатоцитах фермента:

А. Гликогенсинтазы. В. Гликогенфосфорилазы.

С. Гексокиназы. D. Глюкозо-6-фосфатазы.

Е. Фосфофрукто- киназы.

11. Реакции биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных токсинов в гепатоцитах протекают или путем окислительно-восстановительных и гидролитических преобразований, или путем конъюгации. В ходе конъюгации к соединению, которое обезвреживается, не может присоединиться остаток:

А. Глюконовой кислоты. В. Глюкуроновой кислоты.

С. Серной кислоты. D. Глицина.

Е. Глутамина.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА