Выявление особенностей культуры микроорганизмов в процессе ее развития при регистрации комплекса характеристик

В данном разделе демонстрируются возможности комплексного использования регистрируемых характеристик нативных клеток на примере галобактерий в процессе их культивирования.

Известно, что аэробные солевые бактерии Halobacterium halobium способны к фотосинтетическому образованию АТФ. Возможность процесса фотофосфорилирования в этих клетках связывают с наличием в клеточной стенке галофила особых мембранных комплексов - пурпурных мембран (ПМ) или бактериородопсина (БР). В связи с этим интересно выяснить условия культивирования солевых бактерий, которые способствуют интенсификации процесса накопления ПМ в клетках галофила.

Для выполнения этой задачи необходимо, по-видимому, предъявить два основных требования при выборе метода исследования. Такой метод, во-первых, должен обеспечить изучение без нарушения структуры культивируемых клеток и, во-вторых, дать объективный критерий для оценки содержания БР в клетках. Для этого воспользовались методами спектроскопии ПВО.

В предыдущих разделах было обращено внимание на периодические изменения спектральных характеристик галофильных бактерий в ходе процесса культивирования. Предположив, что эти изменения связаны с важными функциями клеток в период развития микроорганизмов, решили детально изучить по изменениям спектров МНПВО в ИК-диапазоне особенности культуры в часы повторения периодов.

Проведена серия экспериментов по культивированию галофила с отбором проб для записи спектров МНПВО с интервалом 1 час. При анализе спектров поглощения бактериальных клеток различного возраста выявлена периодичность в изменениях спектральных характеристик культуры с интервалом 20-24 час. На рис. 6.1 приведены спектры только первого периода, так как изменения в это время наиболее выражены. Спектры записаны при глубине проникновения света в клетки примерно на 0,3 и 1,0 мкм для различных составляющих плоскополяризованного света.

Обращает на себя внимание резкое возрастание полосы поглощения с максимумом в области 1580 см ^-1, которая превышает полосы поглощения в области амид 1 и амид 2, принадлежащие в основном белкам. Очевидно, что в эти фиксированные временные точки происходят резкие биохимические изменения в клетках, которые выявляются по изменениям оптических характеристик. При глубине проникновения светового потока на 0,3 мкм такие изменения выражены слабо (рис. 6.1, Б), тогда как при глубине проникновения света в образец на 1,0 мкм (рис. 6.1, А) они весьма существенны. Напрашивается вывод, что значительные перестройки в клетках происходят либо на границе с цитоплазмой, либо в самой цитоплазме. Спектр, записанный для перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света, особенно четко отражает эти изменения.

Рис. 6.1. Рис. 6.2.

Рис. 6.1. Спектры МНПВО культуры солевых бактерий: ׀ - для перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света, ׀׀ – для параллельной составляющей плоскополяризованного света. А – на ИЭ-ах из КО-2, Б – на ИЭ-тах из германия. 1 – 19 ч ферментации, 2 – 22 ч, 3 – 23 ч.

Рис. 6.2. Спектры МНПВО культуры солевых бактерий: а - для перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света, б - для параллельной составляющей плоскополяризованного света. 1 – на ИЭ-тах из германия, Б – на ИЭ-тах из КО-2

Важно отметить еще одну особенность приведенных спектров. Так, спектры 21- и 23-часовой культур почти идентичны, в то время как спектр 22-часовой культуры существенно отличен. Следовательно, в клетках происходит относительно кратковременный скачок резких биохимических изменений, происходящих менее чем за 2 час.

Из данных рис. 6.1 следует также, что интенсивность полосы поглощения в области 960 см ^-1 была одинакова при измерении на элементах из германия и оптической керамики, т. е. при разных глубинах проникновения светового потока в образец. Следовательно, эта полоса принадлежит компоненту, расположенному не далее 0,3 мкм от поверхности клетки, т. е. в клеточной стенке или 5 0клеточной оболочке. Анализ спектральных характеристик различных компонентов, выделенных из галофильных бактерий, показал, что указанная полоса поглощения принадлежит пигментам, выделенным по методике. По времени наибольшая интенсивность этой полосы наблюдается после спада изменений в области 1580 см ^-1.

Полученные спектры галофилов требуют расшифровки. Для этого были получены спектральные характеристики отдельных компонентов клетки, выделенных по ранее описанным методикам: пурпурных мембран, каротиноидов в смеси с липидами, пигментов, белкового компонента пурпурных мембран. Следует отметить, что используемый метод выделения белка из БР приводит, по-видимому, к его денатурации. Спектры всех выделенных компонентов записаны с использованием элементов из германия и оптической керамики для обоих составляющих плоскополяризованного света. Изучение ориентации молекул белка в ПМ выполнено на основании анализа интенсивностей полос поглощения в спектре МНПВО для перпендикулярной и параллельной компонент плоскополяризованного света.

На рис. 6.2 приведены спектры МНПВО ПМ. Особое внимание заслуживает дихроизм полосы амид 2, увеличивающийся по мере удаления света от поверхности ИЭ-та. Зависимость дихроизма от глубины проникновения света в образец объясняется тем, что оседание из раствора на плоскую поверхность асимметричных молекул сопровождается ориентацией этих молекул в плоскости. Можно, вероятно, считать, что обнаружена самопроизвольная плоскостная ориентация белковых макромолекул в сравнительно сложной системе, какой являются ПМ.

Естественно, возникает вопрос: сохраняет ли обнаруженные свойства белок, выделенный из ПМ? Из данных, представленных на рис. 6.3 следует, что полосы поглощения выделенного белка не обнаруживают дихроизма. Это говорит о том, что белок при выделении его из ПМ теряет необычную пространственную структуру. По-видимому, это может быть следствием как денатурации белка в процессе выделения, так и нарушения структурных взаимодействий компонентов комплекса (белок - липиды).

Таким образом, с нашей точки зрения, есть основание считать, что ярко выраженный дихроизм полосы амид 2 является характеристикой нативной структуры БР-комплекса и может быть взят как объективный критерий для оценки содержания и состояния ПМ в клетках галофила. Это наглядно демонстрируется измерением дихроизма в области полосы амид 2 в процессе выделения ПМ из клеток, т. е. по мере увеличения удельной концентрации БР в образцах. Индексы при А (А = D_׀׀ / D_┴) соответствуют следующим фракциям: 1 - лизат клеток; 2 - осадок после промывки лизата 25%-ным раствором NаС1, 3 - осадок после промывки 0,4 М раствором NаС1; 4 - после первой промывки водой, 5 - после второй промывки водой. Были получены следующие значения: А₁=1,30; А₂ =1,00; А₃ = 0,87; А₄ = 0,85; А₅ = 0,83. Как следует из полученных результатов, по мере удаления посторонних веществ (т.е. при увеличении удельной концентрации ПМ) дихроизм возрастает и достигает максимального значения для препарата ПМ. Поясним смысл использования величины А для оценки дихроизма в БР-содержащих системах.

ПМ составляют незначительную часть общего белкового состава клетки и обнаружить дихроизм отдельных полос поглощения в клетке достаточно сложно. Поэтому и был предложен метод измерения дихроичного отношения, который позволяет измерять малые степени ориентации непосредственно на двухлучевом спектрофотометре. В этом методе используются два поляризатора. Один помещен в измерительный канал, другой - в канал сравнения. Две плоскости поляризации должны образовывать между собой прямой угол. Необходимо, чтобы поляризаторы в этих каналах имели азимут поляризации 0^О и 90^О. Для любых других углов при каждом отражении от рабочих поверхностей измерительного элемента будет происходить сдвиг по фазе между параллельной и перпендикулярной составляющей плоскополяризованного света и поляризация из линейной превращается в эллиптическую. Затем измерительный элемент располагают в том месте спектрофотометра, где оба световых потока смешиваются, и производится регистрация отношения интенсивностей двух световых потоков, один из которых поляризован параллельно, а другой перпендикулярно плоскости падения, т. е. рабочей поверхности измерительного элемента, на которую нанесен образец. Дихроичное отношение равно А = D_׀׀/D_┴. Измеренная интенсивность полосы определяется как р = D_׀׀ - D_┴, р называют "коэффициентом дихроизма" (Збинден, 1966). Используя эти равенства, можно с высокой степенью точности рассчитать дихроичное отношение А.

Описанная методика позволила получить значения А в ходе культивации. Анализ полученных значений А позволил установить, что происходит периодическое изменение дихроизма в области полосы амид 2. Так, для трех периодов экстремальных изменений, обнаруженных в культуре, А₁ =1,7; А₂ =1,5; А₃ =1,45 (А₁, А₂, А₃ - дихроичные отношения для полосы амид 2 в случае первого, второго и третьего периодов соответственно); А максимально для первого периода экстремальных изменений, и ΔА уменьшается от периода к периоду. Эти данные совпадают с уменьшением изменений в спектрах культуры для этих же временных интервалов.

Рис. 6.3. Спектры МНПВО: 1 - Рис. 6.4. Спектры МНПВО ПМ

белкового комп. из ПМ на КО-2: в обл. амид 2: ׀ - _┴ составляющая,

а - _┴ составляющая, ׀׀ – ׀׀ составляющая

б - ׀׀ составляющая;

2 – каротиноидов на ИЭ-те из германия,

θ = 45^О

Полученные результаты могут свидетельствовать о периодическом, а не о плавном образовании пурпурных мембран в клетках.

Следует отметить, что степень дихроизма полосы амид 2 в клетках и выделенных препаратах БР зависит от условий ферментации солевых бактерий. На рис. 6.4 представлены спектральные характеристики препаратов ПМ, выделенных из клеток, выращенных в различных условиях. Различная степень дихроизма, вероятно, может характеризовать "качество" ПМ, т.е. быть критерием оценки состояния ПМ. Решение этой задачи безусловно требует сочетания оптических методов, метода ЯМР и химического анализа липидного и белкового состава ПМ.