Исследование динамики поступления и утилизации углеводорода в клетках микобактерий при регистрации изменения градиента химических компонентов

В данном разделе на примере микобактерий ставится задача показать возможности получения информации при регистрации динамики изменения градиента химических компонентов среды обитания, утилизируемых нативными клетками.

Микобактерии играют важную роль в окислении углеводородов в природе. Однако в литературе мало сведений о поступлении, локализации и потреблении углеводорода в клетках этих микроорганизмов, и получены они при изучении разрушенных или убитых бактерий.

Поэтому было проведено исследование поступления и дальнейшего превращения углеводорода в различных областях интактных клеток микобактерий в течение всего периода их роста и развития.

Культуру Мусоbacterium раrаffinicum выращивали на среде с гексадеканом на качалке при 26-28^о С. Пробы отбирали вначале ежедневно, затем через 2-3 дня. Клетки из 1-й и 2-й пробы перед анализом отмывали петролейным эфиром от исходного углеводорода. Клетки каждой пробы микроскопировали. Нанесение клеток на ИЭ-ты, а также проверка на выживаемость были описаны ранее. Был проведен анализ спектральных характеристик клеток на 1-е, 2-е и 3-и сутки культивирования с отмывкой и без отмывки от гексадекана, а также изучены характеристики свободного гексадекана. Анализ показал, что одно- и двухсуточную пробы необходимо отмывать от исходного углеводорода, на 3-и сутки отмывка сушественно не сказывается на результатах эксперимента, и ее можно в дальнейшем исключить.

В работе были использованы ИЭ-ты из германия и оптической керамики КО-2, рассчитанные и изготовленные так, чтобы обеспечить проникновение светового потока в исследуемый образец на глубину 0,25 и 1,0 мкм соответственно. Поскольку клетки используемых микобактерий имеют в поперечнике 0,8-1,0 мкм, то ИЭ из КО-2 дает возможность получать информацию о всей клетке, а из германия - об области клеточной стенки, цитоплазматической мембране и прилегающем слое цитоплазмы.

О поступлении углеводорода в различные области клеток судили по интенсивности полос поглощения в области 2900 и 1460 см ^-1, а также по перераспределению этих и других полос поглощения. Естественно, что количественный анализ на основе полученных данных затруднен из-за присутствия в клетках компонентов, также участвующих в формировании указанных полос поглощения. Однако качественный анализ на основании полученных результатов вполне возможен. О накоплении липидов судили по полосе 1740 см ^-1. Как было показано ранее, культура, растущая на среде с гексадеканом, образует 25% свободных липидов, главными фракциями которых являются пептидогликолипиды и триглицериды. Спектральные характеристики этих соединений резко различны. В ИК-спектре пептидогликолипидов интенсивность полосы 1740 см ^-1 невелика в противоположность ИК-спектру триглицеридов (рис. 3.1). Поэтому образование полосы в этой области относили, главным образом, к содержанию триглицеридов в клетках.

Рис. 3.1. Инфракрасные спектры: гексадекана (1), триглицеридов

Mycobact. paraffinicum (2), пептидогликолипидов Mycobact. paraffinicum (3)

Поскольку в области полосы амид 1 поглощают также углеводы, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, можно считать, что эта область относится ко всей клетке. Поэтому полосу поглощения 1660 см ^-1 выбрали в качестве опорной и относительно нее произвели расчет оптических плотностей интересующих полос поглощения. Параллельно проводили микроскопическое исследование клеток.

Сравнительный анализ спектральных характеристик всей клетки, а также области, ограниченной 0,25 мкм, показывает, что в течение первых двух суток культивирования происходит резкое увеличение содержания гексадекана в наружных слоях клетки (рис. 3.2). Интенсивность "углеводородных" полос в спектрах всей клетки также возрастает. Однако это возрастание определяется скорее всего накоплением гексадекана в слое 0 - 0,25 мкм. В пользу именно такой интерпретации спектра говорит резкое уменьшение полосы 1740 см ^-1 (сложные эфиры жирных кислот) в области 0 - 0,25 мкм, практически не изменившейся у всей клетки. Это уменьшение происходит в результате снижения концентрации липидов из-за увеличения содержания в этом слое гексадекана. Естественно, что при этом не происходит значительного уменьшения липидной полосы поглощения в спектрах всей клетки, так как гексадекан оказывается локализованным в ограниченном пространстве клетки. Рассматриваемый этап культивирования (в течение первых двух суток) заканчивается наступлением состояния насыщения внешнего слоя клеток углеводородом. В это время культура находится в начале фазы логарифмического роста. Клетки палочковидные, собраны в скопления, представляющие собой суспензию клеток в капле углеводорода.

Рис. 3.2. Относительные изменения полос поглощения всей клетки

Mycobact. paraffinicum (а) и области 0,00 – 0,25 мкм (б) в течение всего периода роста: 1 – А₁₄₆₀, 2 – А₁₅₅₀, 3 – А₁₇₄₀.

Следующий (второй) этап культивирования продолжается двое суток и характеризуется состоянием относительной стабильности интенсивностей "углеводородных" полос поглощения для слоя 0- 0,25 мкм. Нужно отметить, что продолжительность этого периода может варьировать от опыта к опыту. Увеличение интенсивности полосы 1740 см ^-1 в спектрах всей клетки свидетельствует о том, что начинает происходить некоторое увеличение концентрации липидов в цитоплазме. Микроскопическое исследование показало, что на протяжении 2-х и 3-х суток развития скопления клеток становятся более плотными. Клетки, встречающиеся вне скоплений (их мало), окружены слоем гексадекана, толщина которого сравнима с поперечником клетки. Этот слой начинает уменьшаться на исходе 3-х суток.

Затем наступает третий этап (примерно трое суток) активной утилизации углеводорода клетками и синтезом триглицеридов. В области, ограниченной 0,25 мкм, наблюдается значительное снижение интенсивностей углеводородных полос, что находит свое отражение и в спектрах всей клетки. Интенсивность липидной полосы 1740 см ^-1 для наружного слоя возвращается к первоначальному значению, В то же время интенсивность этой полосы в спектрах всей клетки возрастает намного сильнее: в 7-суточной пробе в 2,5 раза относительно первоначального значения. Таким образом, утилизация углеводородов культурой связана со значительным увеличением содержания триглицеридов в цитоплазме. В этот период развития скопления клеток продолжают уплотняться, превращаясь в округлые комки. В 7-суточной пробе наряду с палочковидными много кокковидных клеток. Ореол гексадекана вокруг клеток совершенно исчез.

Следующий (4-й) этап культивирования характеризуется исчезновением углеводородного субстрата в клетке. Содержание гексадекана в области 0-0,25 мкм еще несколько снижается, достигая минимального значения. Наибольшие изменения происходят в содержании триглицеридов. Накопление их в цитоплазме достигает максимума. Повышается концентрация этих соединений и в наружных слоях клетки. Затем происходит снижение интенсивности липидной полосы как у всей клетки, так и в области 0,25 мкм.

Заключительный этап культивирования (после 13 суток) характеризуется стабилизацией по интенсивности всех полос поглощения как для всей клетки, так и для слоя 0,25 мкм. В 14-суточной пробе клетки имеют вид очень коротких палочек и кокков, часто соединенных в цепочки. Наряду со скоплениями много отдельно плавающих клеток. Такая картина сохраняется и в следующие сутки. Деградации культуры не наблюдается.

Полученные результаты показывают, что на среде с гексадеканом происходит быстрое (в течение суток) насыщение углеводородом внешних слоев клетки толщиной не более 0,25 мкм. Углеводород, "не вместившийся" в этот слой, адсорбируется на поверхности клетки. Накопления гексадекана в центральной части клетки не наблюдается. По мере окисления и утилизации исчезает адсорбированный на поверхности клетки субстрат, но уровень его во внешнем слое еще остается высоким (второй этап культивирования), затем количество гексадекана начинает снижаться.

Окисление углеводорода клетками сопровождается накоплением триглицеридов в стационарной фазе роста, большая часть которых концентрируется в цитоплазме. Последующее значительное снижение количества триглицеридов свидетельствует об использовании этих соединений клеткой в качестве внутреннего резерва. Наступающая затем стабилизация всех параметров говорит о затухании метаболических процессов, связанных с окислением углеводорода, и наступлении состояния покоя.

Представленные выше результаты дают информацию о поглощении и окислении гексадекана клетками микобактерий. Клетки и их внешние слои были охарактеризованы по содержанию липидов и других клеточных компонентов в течение всего периода их роста на среде с углеводородом. Были проведены аналогичные исследования, выращивая ту же культуру на средах с углеводом (глюкоза) и на мясопептонном бульоне (МПБ). Полученный экспериментальный материал позволяет сравнить клетки микобактерий и их внешние слои по содержанию в них липидов, углеводов и белков в течение всего периода их роста и проследить за изменением этих параметров в зависимости от типа ростового субстрата.

Сравнительный анализ спектральных характеристик всей клетки, а также области, ограниченной клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной (КС+ЦПМ), показывает, что на среде с глюкозой в 1-е и 2-е сутки культивирования происходит очень большой по интенсивности (в несколько десятков раз) скачок полосы в области 1740 см ^-1 (сложные эфиры жирных кислот) (рис. 3.3, рис. 3.4). Причем если количественно сравнить интенсивность этой полосы для всей клетки и области 0-0,25 мкм (КС+ЦПМ), то видно, что они практически совпадают. Эти результаты дают основание полагать, что градиент концентрации липидов в клетке и ее внешней части примерно одинаков, т. е. в области КС+ЦПМ содержится большое количество липидов. Заметного качественного различия в липидном составе рассматриваемых областей клетки также не наблюдается, т.е., вероятно, происходит насыщение клеточной стенки липидами, вырабатываемыми внутри клетки.

В последующие 3 суток начинает уменьшаться интеисивность полосы 1740 см ^-1 примерно параллельно для рассматриваемых слоев клетки вплоть до 9-х суток.

Пик углеводной полосы 1100 см ^-1 совпадает с пиком липидной, что позволяет предположить энергичный биосинтез гликолипидов в первые 2 суток роста. Довольно быстро концентрация этих соединений снижается и к 4-м суткам. Затем наблюдается новый подъем липидной полосы, особенно заметный у всей клетки - до 7-х суток культивирования. Скорее всего это происходит за счет биосинтеза триглицеридов, которые концентрируются в основном в центральной части клетки. После 7 суток происходит плавное уменьшение концентрации липидов как во всей клетке, так и во внешнем ее слое, что связано с использованием триглицеридов клеткой в качестве внутреннего резерва.

Рис.3.3. Изменения полос всей клетки Рис.3.4. Изменения полос всей клетки

(а) и области 0 – 0,25мкм (б) на среде (а) и области 0 – 0,25мкм (б) на среде

с глюкозой на МПБ

Сравнивая полученные данные с аналогичными, полученными для клеток, выращенных на среде с гексадеканом, можно отметить, что наблюдаемые изменения в отношении нейтральных липидов имеют сходный характер. Однако при использовании среды с углеводородом нам не удалось выявить изменений липидной кривой в начале экспоненциальной фазы роста, что было связано со значительным разбавлением липидов поступившим в клеточную стенку гексадеканом. Отсутствие разбавителя, а также меньшее количество нейтральных липидов в клетках, выросших на среде с глюкозой, позволяет выявить образование структурных липидов, по-видимому, гликолипидов. Оно энергично идет параллельно с ростом культуры, достигая максимума на 2-е сутки. Интенсивный подъем и быстрое снижение липидных полос в клетке и ее внешней части в логарифмическую фазу роста культуры можно объяснить, опираясь на данные. Эти авторы показали, что при биосинтезе липидов клеточной стенки микобактерий вначале образуется 6-миколил-6'-ацетилтрегалоза - гликолипид, в котором миколовая кислота соединена сложноэфирной связью с трегалозой. Затем происходит быстрое расщепление этого соединения и, следовательно, элиминирование сложноэфирной связи; освобождающиеся миколовые кислоты насыщают клеточную стенку. Мономиколат трегалозы содержится в клетке исследуемой бактерии. Таким образом, спад липидной полосы, наблюдаемый на 4-е сутки роста, можно трактовать как окончание формирования клеточных стенок микобактерий, что совпадает с завершением логарифмической фазы роста и переходом в стационарную. Как и на среде с гексадеканом, после 14 суток культивирования наблюдается стабилизация всех параметров. Можно сделать вывод, что у клеток, растущих на среде с глюкозой, формируется достаточно липофильная клеточная стенка.

Спектральные характеристики клеток этой культуры, выращенных на МПБ (рис. 3.4 а, б), имеют совершенно иной вид. Хотя, как и в опыте с глюкозой, также наблюдается возрастание интенсивности полосы 1740 см ^-1 на 2-е сутки культивирования, однако оно меньше примерно в 10 раз. Кроме того, интенсивность указанной полосы для всей клетки почти в 2 раза выше, чем для области КС+ЦПМ. Возврат к первоначальной интенсивности полосы 1740 см ^-1 для области 0-0,25 мкм произошел уже 4-м суткам культивирования. Для всей клетки этот возврат наступает лишь к 14-м суткам роста. Для всей клетки наблюдается также заметное возрастание интенсивности полосы 1100 см ^-1 (углеводные компоненты клетки), менее выраженное во внешних областях клеток. Однако отсутствует стабилизация всех параметров после 13 суток роста, как это имело место в "гексадекановых" и "глюкозных" клетках. Содержание углеводных и белковых компонентов меняется вплоть до 17 суток роста, и лишь количество липидов снижается до исходной величины у всей клетки на 14-е сутки, а во внешней области - на 4-е сутки.

Таким образом, в клетках, растущих на МПБ, липидов образуется крайне мало по сравнению с клетками, выращенными на среде с гексадеканом или глюкозой. Максимум, обусловленный биосинтезом структурных липидов, приходится на 2-е сутки роста, как и в опыте с глюкозой. Однако подъем, вызванный образованием триглицеридов, не выражен. Это указывает на весьма низкое содержание этих соединений в клетках, выращенных на МПБ. Причем во внешних слоях клетки их нет вообще. Параллель в подъеме липидов и углеводов в начале логарифмической фазы роста, столь ярко выраженная в "глюкозном" варианте, здесь отсутствует. В отличие от него имеется параллельный подъем липидов и полосы 1550 см ^-1 (полипептиды и белки). Возможно, в этом случае в клеточной стенке формируются преимущественно пептидолипиды, а не гликолипиды. В целом же клеточная стенка, образующаяся при росте микобактерий на МПБ, значительно менее липофильна, чем при росте на среде с глюкозой.

Таким образом, исследование клеток, выращенных на разных средах, проведенное в течение всего периода их роста, показало, что как клетки, так и их внешние слои значительно различаются по биохимическому составу. Эти различия проявляются уже с 1-х суток роста и сохраняются в дальнейшем. Они особенно отчетливо обнаруживаются при сопоставлении данных по содержанию липидов в клетках, использовавших для роста разные субстраты: МПБ, глюкозу, гексадекан. Так, при использовании глюкозы формируется весьма липофильная клеточная стенка. Гидрофобность стенки еще более возрастает при росте на среде с углеводородом: в стенках таких клеток содержится значительно больше специфических липидов - пептидогликолипидов, миколовых кислот. Однако при росте на МПБ липофильность клеточной стенки резко падает. Это согласуется с данными, полученными ранее биохимическими методами, о том, что в клетках микобактерий, растущих на МПБ, значительно меньше свободных липидов и в том числе миколовых кислот.

Совокупность настоящих и ранее полученных данных позволяет заключить, что в клетках сапрофитных микобактерий имеется эффективная система регуляции синтеза биополимеров клеточной стенки. Сигналом к перестройке стенки является природа ростового субстрата. При этом имеет значение не только степень гидрофобности субстрата, но и его принадлежность к определенному классу химических соединений. Процесс регуляции осуществляется, по-видимому, прежде всего путем синтеза липидных компонентов клеточной стенки - миколовых кислот. Поскольку промежуточными соединениями в синтезе миколовых кислот являются гликолипиды, то ясно, что углеводный субстрат (глюкоза) в большей степени способствует их образованию, чем МПБ.

Исходя из того, что клетки, выращенные на разных субстратах, формируют клеточную стенку с различной степенью гидрофобности, можно предположить, что при контакте с гидрофобным субстратом такие клетки будут воспринимать его по-разному. Было изучено влияние условий предварительного культивирования клеток микобактерий на рост их в среде с гексадеканом. Оказалось, что выращивание инокулята на МПБ приводило к задержке роста на сутки по сравнению со средой с глюкозой или с гексадеканом. Учитывая, что углеводород поступает в клетки микобактерий пассивно-диффузионным путем, солюбилизируясь в липидах клеточной стенки, можно утверждать, что наблюдаемый длительный период адаптации в случае клеток, предварительно выращенных на МПБ, связан прежде всего с усиленным синтезом специфических стеночных липидов и перестройкой клеточной стенки.

В данном разделе было стремление показать возможности разработанной методической базы при получении информации об изменении градиентов концентрации биохимических компонентов в нативных клетках.