Характеристика криптобиотического состояния спор при регистрации изменения градиента степени пространственной организации биохимических компонентов интактных клеток

Как уже было сказано, организм можно рассматривать как систему лабильных информационных взаимодействий, находящуюся в постоянно меняющемся внешнем информационном поле, что подразумевает обмен информацией и со средой обитания. Этот подход заставляет обратить особое внимание на пограничные структуры организма как на избирательный информационный фильтр, в определенной степени способный регулировать меру воздействия среды обитания на организм. Природа предоставила нам интереснейший в этом отношении объект - микроорганизмы, способные образовывать споры, переходя в состояние крайнего анабиоза. В процессе спорообразования практически полностью утрачивается одно из основных свойств живой материи - обмен веществ и энергии со средой обитания.

Можно полагать, что спора - это "фиксированное физиологическое состояние" клетки. Принципиальным является то, что здесь нет динамики процесса. Поэтому, вероятно, нет и динамики изменения внутриклеточных структур. Следовательно, можно "чисто" провести регистрацию этих структур и сопоставить "состояние" данной клетки и зарегистрируемых структур, т.е. связать информацию о структуре и функции. Такова была идея при постановке задачи. Приведем полученные результаты и дадим интерпретацию.

Эндогенное спорообразование у бактерий является своеобразным типом прокариотической клеточной дифференцировки, изучение которого представляет значительный интерес не только в связи с возможностью обнаружения на этой модели универсальных биологических закономерностей дифференциации клеток, но и выяснения причин и специфических механизмов, обусловливающих возникновение у бактериальных спор уникального для живых объектов состояния криптобиоза - крайней степени анабиоза.

Наиболее интересным аспектом этой проблемы, с нашей точки зрения, является изучение изменения гетерогенности структурной организации клетки в процессе перехода: вегетативное состояние - спора - вегетативное состояние. Эти изменения могут выражаться в одном случае вариациями биохимического состава, в другом - изменениями пространственной организации макромолекул при неизменном биохимическом составе клетки, в третьем - одновременными изменениями характеристики объектов по двум указанным параметрам. Конкретно нас интересовала возможность получения информации, позволяющей судить не только о наличии или количестве в споре, важнейших биополимеров (белков, нуклеиновых кислот, липидов, полисахаридов), но и об их пространственном распределении, а также

Рис. 1.1. Ультратонкий срез спорулирующей клетки Cl. Pectinofermentans:

Э – экзоспориум, П – покровы споры, ВМ – внешняя мембрана споры, ВнМ – внутренняя мембрана споры, Ц – цитоплазма сердцевины, Н – нуклеоид, К – кортекс, КС – клеточная стенка материнской клетки

структурной организации в клетках, одним из параметров которой является определенная ориентация в макромолекулах основных химических связей.

Объектом исследования были споры и вегетативные клетки анаэробной почвенной бактерии Сlоstridium pektinofermentans 15. Культуру выращивали на среде следующего состава (в г/л): (NH₄)₂НРO₄ - 1,4, K2НРO₄ - 1, МgSO₄ - 1, NаСl - 1, СаСО₃ - 3, глюкоза - 10. Вегетативные клетки отбирали для исследований через 2 часа (лаг-фаза), 12 час. (lоg-фаза) и 24 часа (стационарная фаза) роста, а споры - через 8 суток инкубирования на плотных средах в анаэростатах под вакуумом (10^-1). Зрелые споры собирали и отделяли от остатков вегетативных клеток методом дифференциального центрифугирования. Метрические параметры вегетативных клеток, спор и отдельных слоев клеточных структур приведены в табл. 1.1.

Измерения толщины вегетативных клеток и спор сделаны в прижизненном состоянии под фазово-контрастным микроскопом. Средние значения толщины отдельных клеточных слоев измеряли на электронно-микроскопических снимках ультратонких срезов клеток. Ультратонкие срезы готовили следующим образом: клетки фиксировали по методу, заливали в аралдит, а затем подвергали микротомированию на ультрамикротоме LКВ-3. Срезы окрашивали по Рейнольдсу и фотографировали в электронном микроскопе JЕМ-7 при инструментальном увеличении 40 000. Особенности ультраструктуры спор Сl. Pectinofermentans представлены на рис. 1.1. Используемый для анализа материал, содержащий вегетативные клетки или споры, готовили в виде водной пасты, которую наносили на ИЭ и подсушивали при комнатной температуре в токе воздуха. При этом использовали такой способ нанесения объекта, в результате которого вегетативные клетки и споры располагались одним слоем, а длинная ось клеток была параллельна поверхности измерительного элемента. Вопросы, связанные с нанесением объекта на поверхность измерительного элемента, рассмотрены в работах. Время от нанесения объекта на элемент до начала записи характеристик не превышало 5 - 10 мин. (время регистрации несколько минут).

В опытах были использованы измерительные элементы из оптической керамики (КО-2), кремния, германия и других материалов с целью обеспечения проникновения света в споры на глубину 1,0, 0,5 и 0,25 мкм (в расчетах принималось, что показатель преломления спор равен 1,5). При записи спектров в поляризованном свете угол падения светового потока θ = 45^о, так как для этого угла в случае изотропного распределения молекул d_эф׀׀/d _эф┴ = 2. Оценка эффективной толщины может быть проведена по оптической плотности, которая связана с d_эф зависимостью D = -lnR = αNd_эф. Следовательно, для изотропного образца будет выполняться соотношение D_׀׀ / D_┴ = 2. Любое отклонение от этого значения характеризует преимущественную ориентацию образца относительно плоскости падения светового потока. Отметим, что приведенные рассуждения справедливы при

Таблица 1.1

Рис. 1.2. Схема строения зрелых спор Cl. Pectinofermentans 15 (по данным электронной микроскопии) и распределения клеточных структур по слоям, подвергнутым световому зондированию. Обозначения те же, что и на рис. 1.1

определенных условиях. При исследовании спор было выбрано θ > θ_кр, что дает возможность вести анализ даже сильных амидных полос.

Спектральные характеристики, полученные в поляризованном свете, дают информацию о тех процессах, которые выражаются в пространственной переориентации отдельных (белковых, липидных, и т. д.) макромолекул. Можно предположить, что преимущественная ориентация определенных химических связей в ансамблях макромолекулярных компонентов споры (что находит отражение в спектрах) может характеризовать in vivo организованность биосистемы (соответственно и ее функциональное состояние) в определенный момент времени. Именно это узкосмысловое толкование вкладывается в понятие структурных изменений биополимеров споры.

Использованные рабочие значения глубин проникновения светового потока (1,0; 0,5 и 0,25 мкм) обеспечили возможность получения информации с целой споры, ее половины и клеточного слоя, включающего структуры от экзоспориума до внутренней мембраны споры (рис. 1.2 и табл. 1.3).

Поскольку проведение спектрального анализа неразрушенных клеток в различных областях их структурных организаций (по слоям) является принципиальным методом в настоящем исследовании, то помимо теоретичес

кой возможности выполнения такого анализа следует привести экспериментальные доказательства практической реализации такой возможности. С этой целью должны быть сформулированы условия, выполнение которых гарантирует однозначность ответа о получении спектральной информации с разных глубин проникновения светового потока в клетку. Эти условия следующие: 1) появление на разных глубинах проникновения светового потока в клетку новых полос поглощения; 2) изменение соотношения полос поглощения, характеризующих определенные биохимические компоненты (что должно свидетельствовать о различии в градиентах концентрации этих компонентов в анализируемых слоях клетки); 3) вариации в дихроичных отношениях интенсивностей полос поглощения на разных глубинах клетки. На рис. 1.3 представлены спектры, подтверждающие выполнение сформулированных условий. Так, на глубине 0,25 мкм отсутствует полоса поглощения в области 1240 см ^-1, принадлежащая в основном нуклеиновым кислотам, а полоса поглощения в области 1740 см ^-1, за которую отвечают липиды, значительно интенсивнее, чем на глубине 0,5 и 1 мкм, что согласуется с электронно-микроскопическими и биохимическими данными об отсутствии в слое от экзоспориума до цитоплазматической мембраны нуклеиновых кислот и наличии в этом слое липидных компонентов.

В предыдущих разделах было показано, что целым живым клеткам свойственна определенная степень упорядоченности находящихся в них биополимеров (дихроичные отношения полос поглощения, характеризующие основные клеточные биополимеры, имели значения, отличные от 2).

Рис. 1.3. Спектры спор Cl. Pectinofermentans 15:

1 – спектр с глубины 0,25 мкм,

2 – спектр с целой клетки

Данные этого раздела, полученные при исследовании целых вегетативных клеток (табл. 1.2), согласуются с данными, полученными на других объектах. Однако спектроскопические исследования спор (табл. 1.3) позволили получить совершенно иные результаты. В табл. 1.3 представлены средние из пяти измерений данные расчетов дихроичных отношений для различных полос поглощения спорового материала. Особого внимания, на наш взгляд, заслуживает факт изотропности при просмотре целой споры, а также увеличение анизотропии по мере исследования отдельных клеточных слоев в различных областях поглощения. Так, дихроичные отношения полос амид 1 и амид 2 при анализе целой споры равны 2, что предполагает изотропию по данному параметру. По мере светового деталирования споры анизотропия возрастает и наибольшая упорядоченность, характеризуемая полосами поглощения амидных связей, наблюдается в слое 0 - 0,25 мкм, включающем клеточные структуры от экзоспориума до внутренней споровой мембраны. Сравнение полученных спектральных характеристик спор с аналогичными характеристиками вегетативных клеток той же культуры, взятых в лаг-фазе, экспоненциальной и стационарной фазах роста, выявило между ними существенные различия (табл. 1.2 и 3).

Спектры с целых вегетативных клеток характеризуют определенную анизотропию объекта, которая меняется по мере деталирования его световым зондом. Изотропию, наблюдаемую в слое 0,25 мкм, включающем клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану с прилегающим слоем цитоплазмы, склонны рассматривать как следствие скрытой анизотропии. Последняя

Таблица 1.2

может быть скрыта из-за наличия скоростных процессов, происходящих в клетке, что потребует в дальнейшем исследования процессов, протекающих в

Таблица 1.3

определенных узких временных интервалах.

Анализ полученных данных позволяет предположить, что изотропия, обнаруженная в структурной организации молекул белков в покоящейся споре, может рассматриваться в качестве одного из объективных показателей криптобиотического состояния бактериальных спор. Вместе с тем в споре есть отдельные участки (клеточный слой от экзоспориума до внутренней мембраны споры), характеризующиеся пространственной упорядоченностью белковых молекул, что выявляется только при исследовании отдельных слоев споры.

Можно предположить, что при световом зондировании более узких слоев клетки (включая отдельные клеточные ультраструктуры) и регистрации скоростных процессов могут быть получены принципиально новые данные о функциональном состоянии макромолекул непосредственно в живых интактных клетках микроорганизмов.

Одной из важных сторон в исследовании покоящихся форм микроорганизмов является получение информации, в том числе спектральной, об изменении структурной организации клетки в процессе перехода вегетативная клетка - анабиотическая (гипометаболическая) форма - вегетативная клетка. Для этих целей было использовано выделение физиологически активных специфических мембранноактивных метаболитов бактерий - фактора d₁ (алкилоксибензолов). С его помощью экспериментально получают покоящиеся (цистоподобные) формы микроорганизмов, находящиеся в гипометаболическом или глубоком анабиотическом состоянии. Эти покоящиеся формы обладают рядом существенных характеристик, свойственных таким анабиотическим клеткам бактерий, как эндоспоры и цисты. Поэтому этот фактор, влияющий в зависимости от его концентрации на степень метаболической активности клетки в целом, может использоваться как инструмент при изучении перехода от метаболически активного к гипометаболическому или анабиотическому состоянию и определении глубины покоя.

Была поставлена цель изучить пространственную организацию биополимеров in vivo в анабиотических клетках, образующихся под влиянием фактора d₁ и сравнить полученные результаты с аналогичными исследованиями по спектральными характеристиками эндоспор (рис. 1.3).

Объектом исследования служила культура грамположительных бактерий Вacillus cereus, штамм 504 (ВКМ), выращенная на минеральной среде Агресса c 0,2% глюкозы. Для исследования использовали клетки экспоненциальной и линейной фазы роста. Фактор d₁, его получение и работа с культурой описаны в литературе. Используемый для анализа материал, содержащий клетки культуры, отбирали каждые 20 мин и наносили на ИЭ. Время от нанесения объекта на ИЭ до регистрации характеристик не превышало 5 мин. В опытах были использованы ИЭ-ты из оптической керамики, германия и других материалов с целью обеспечить проникновение света в клетки на глубину примерно от 0,2 до 1,0 - 1,2 мкм. Принималось, что размеры вегетативных клеток исследуемой культуры составляют примерно 2-3 мкм.

Результаты, полученные при исследовании целых вегетативных клеток контрольной культуры, свидетельствуют о том, что целым живым клеткам свойственна определенная степень пространственной упорядоченности для белковых компонентов, так как дихроичные отношения для полос поглощения амид 1 и амид 2 имели значения, отличные от 2. Дихроичные отношения для этих же полос, полученные со слоя 0,2 мкм близки к 2, что свидетельствует об изотропном характере распределения суммы белковых компонентов в этом слое. Все эти данные согласуются с результатами спектральных исследований вегетативных клеток микроорганизмов, полученными ранее.

В данном разделе не решался вопрос о том, как степень упорядоченности связать с состоянием культуры, уровнем ее организованности, поэтому не приводим данные изменений дихроичных отношений в различные часы культивирования (чтобы не отвлекать внимание от основной задачи исследования, изложенной выше). При сравнении же результатов, полученных на клетках, подвергнутых действию фактора d₁, с результатами, полученными для контрольной культуры, следует, что для целых вегетативных клеток дихроичное отношение отличается от 2, а для слоев 0,2 мкм - близко к 2. Отметим только, что дихроичные отношения амидных полос для целых вегетативных клеток находились в пределах 1,5 - 1,8.

В таблице 1.4 представлены средние из пяти измерений данные о дихроичных отношениях для полос поглощения амид 1 и амид 2 исследуемых объектов, подвергнутых воздействию фактора d₁. При этом выяснялось изменение спектральных характеристик в зависимости от дозы вносимого фактора и времени развития культуры.

Следует отметить быструю реакцию культуры на действие фактора. Отбор проб проводили каждые 20 мин и уже в первой пробе наблюдалось отклонение для дихроичных отношений по сравнению с данными для вегетативных клеток.

Из таблицы следует, что по своим характеристикам клетки, подвергнутые действию фактора, отличаются от характеристик вегетативных клеток. В частности, это заметно по данным дихроичных отношений для полосы амид 2, относящихся к поверхностному слою толщиной 0,2 мкм гипометаболических клеток, полученных при воздействии 0,5 усл. ед. фактора на культуру экспоненциальной фазы роста. Для дихроичных отношений, полученных по спектрам целых клеток при тех же условиях эксперимента, наблюдаются значения дихроичных отношений, близких к 2, в противоположность этой же характеристике для вегетативных клеток. Отличия наблюдаются и при других условиях эксперимента.

Таким образом, установлено принципиальное отличие параметров спектральных характеристик клеток, подвергнутых действию фактора d₁, от характеристик клеток контрольной культуры.

Особо следует отметить данные для клеток, взятых с линейной фазы роста при воздействии 1,5 усл. ед. фактора. На основании результатов для клеток культуры, выдержанной с фактором в течение 100 мин (при 20-минутном интервале отбора проб), можно сделать вывод о том, что действие фактора на культуру вызывает принципиальные изменения параметров характеристики этой культуры таким образом, что спектры анабиотических клеток, полученных под воздействием фактора d₁ в ряде

Таблица 1.4

случаев близки спектральным характеристикам (для дихроичных отношений) бактериальных спор.

Если цистоподобным анабиотическим формам были свойственны характеристики, представленные для эндоспор, и через 100 мин (т. е. в конце опыта), то для гипометаболических клеток (доза фактора 0,5 усл. ед., культура экспоненциальной фазы роста) к концу опыта наблюдался возврат параметров спектральных характеристик культуры к параметрам, присущим вегетативным клеткам контрольных культур. Может оказаться важным, что возврат этих параметров осуществляется через некоторый колебательный процесс, который отмечается по результатам, приведенным в таблице. Из этих данных следует, что возврат, его характер зависят как от дозы действующего на культуру фактора, так и от возраста культуры (полагаем, и состояния культуры), подвергнутой действию фактора.

Полагаем, что экспериментально получаемые цистоподобные формы можно рассматривать как модель для изучения некоторых универсальных биологических закономерностей, в том числе для изучения переходных состояний биологических систем в цикле биоз - анабиоз.

Приведенные в данном разделе результаты позволяют предложить еще одну их интерпретацию.

Несмотря на фундаментальность открытого в физике дуализма свойств, присущих всем видам материи, при исследовании биологических систем процессы и факты чаще всего рассматриваются с учетом только корпускулярных свойств и без учета волновых свойств материи. Однако, в последние годы все больше появляется свидетельств межклеточных и внутриклеточных взаимодействий волновой природы в живых организмах. Значительная поляризация макромолекул и их частей, а также макромолекулярных комплексов создают условия для большой чувствительности различных структур организма к резонансным им потокам монохроматических излучений. Ряд интереснейших, хотя и дискуссионных работ высказывают версии о волновой природе генома, иммунитета и клеточной дифференцировки. Зарегистрированы сверхслабые излучения (предположительно когерентные) разной длины волны от отдельных компонентов развивающегося куриного яйца. Известно, что низкоинтенсивное когерентное излучение обладает многообразным биостимулирующим действием, основанным на способности монохроматического и высокополяризованного света, не вызывающего явных морфологических изменений в тканях и клетках, положительно влиять на их метаболизм и пролиферативную активность, существенно изменяя различные биохимические, биофизические и физиологические показатели.

В первой главе уже были представлены взгляды об информационном пространстве. Если считать, что внешняя среда - это единое информационное пространство, то в пространстве действуют информационные силы, генерируемые различными частицами, постоянно находящимися в резонансно-частотно-волновых осциллирующих состояниях, создающих напряженность единого информационного поля. В силу информационного состояния пространства свет, звуки, электромагнитные волны передаются на большие расстояния за счет частотного, волнового, резонансного, вибрационного колебаний относительно оси равновесия молекул, атомов и электронов, являющихся переносчиками информации без передачи материальных частиц. При этом ни атомы, ни молекулы на расстоянии не передаются, а передаются их отношения по резонансно-равновесному каналу в соответствии с приложенной информацией.

Биологическую систему (организм) в связи с этим можно представить как совокупность огромного числа резонансных систем, образованных молекулами и молекулярными комплексами, способными лабильно менять свои резонансные характеристики в зависимости от различных структурных изменений, что позволяет сохранять целостность системы (организма) во внешней среде. С этих позиций становится очевидным резонансный механизм влияния солнечных и космических излучений и различных других факторов внешней среды на живые организмы, а также теоретически осмысливаются многочисленные работы по действию низкоинтенсивного лазерного излучения на биологические объекты разного уровня организации.

Обращаясь к представленным выше результатам, можно предположить, что изменение степени пространственной организации может быть связано в том числе и с изменением параметров химических связей макромолекулярных комплексов. Если биологические макромолекулы рассматривать как волновые резонансные системы, то изменение этих параметров должно привести к изменению волновых процессов в данной системе. Упорядочивание или структурирование приводит к резкому сокращению разнообразия резонансных систем в пограничном слое (т.е. к минимизации волновых взаимодействий со средой обитания). Это и характерно для спорового состояния. Сохраняющийся диапазон резонансных частот может служить для восприятия специфического сигнала, побуждающего к переходу в вегетативное состояние. Напротив, изотропия (неупорядоченность) поверхностного слоя вегетативной клетки предполагает наличие большого количества макромолекулярных систем с разнообразным набором резонансных свойств, обеспечивающих возможность обмена информацией клетки со средой обитания.

В вегетативной клетке степень пространственной организации макромолекулярных комплексов постоянно меняется как послойно, так и во времени, что связано с протеканием функциональных процессов, с постоянным обменом энергии. Криптобиотическому состоянию бактериальных спор соответствует достаточная степень изотропии в структурной организации клетки в целом и крайняя анизотропия поверхностного слоя. Возможно, при спорообразовании кинетическая энергия, обеспечивающая функционирование вегетативной клетки, переходит в потенциальную энергию ориентированных связей макромолекулярных комплексов оболочки споры, что позволяет длительное время поддерживать и сохранять биологическую систему в состоянии крайнего анабиоза.

Вероятно, сходный механизм изоляции клетки от воздействий (в т.ч. и волновых) может иметь место и у многоклеточных организмов.

Дальнейшие разработки практических подходов для интерпретации экспериментальных данных с позиций, учитывающих волновые свойства макромолекулярных комплексов биологических систем, позволят вскрыть причины и механизмы чувствительности организмов к многообразным воздействиям внутреннего и внешнего информационного пространства.

В данном разделе на конкретных примерах показаны возможности получения информации о взаимодействии среды и клеток при регистрации изменения градиента степени пространственной организации биохимических компонентов клеток.