Определение количества воды в интактных клетках при регистрации изменения градиента положения основания полос поглощения

Имеются традиционные методы изучения состояния воды в биологических системах. Существует динамическая связь между состоянием воды и физиологическими процессами, протекающими в клетке. Вариабельность такой связи осложняет условия и методы ее изучения, любые воздействия на клетку могут разрушить или изменить их. Методы НПВО позволяют изучать состояние воды в клетках микроорганизмов, находящихся в среде их обитания, не подвергавшихся никакому внешнему воздействию.

Известно, что спектроскопия НПВО может быть применена для определения оптических постоянных целых клеток. Анализ клеток микроорганизмов с использованием методов НПВО показал, что можно выявить изменение их оптических свойств в процессе культивирования. Было сделано предположение, что изменение внутриклеточного водного баланса также может быть выявлено по изменению оптических свойств клеток - показателя преломления целых клеток или их "оптических срезов". При количественном анализе принимаются во внимание оптические постоянные объекта - показатели преломления и поглощения. На примере галофильных микроорганизмов была рассмотрена возможность использования спектроскопии НПВО для выявления изменений внутриклеточного баланса воды в клетке по изменениям показателя преломления клеток бактериальной культуры.

Подготовка объектов к анализу описана в предыдущих разделах. Для измерений использовали элементы из оптической керамики КО-2 и германия с углом падения светового потока θ = 45^О. Все методики работы с приставками и ИЭ-тами описаны в предыдущих разделах данной работы.

Спектральные характеристики клеток и их "оптических срезов" были сняты с культуры галофильных микроорганизмов. Установлено, что в экстремальные по термогенезу периоды роста клеток увеличивается оптическая плотность клеток. Основания полос поглощения смещены в сторону более высоких оптических плотностей. Наибольшие изменения спектральных характеристик зафиксированы для целых клеток, меньшие - для их "спектральных срезов", захватывающих клеточную стенку микроорганизма и цитоплазматическую мембрану.

Для целых клеток в области частот 1800-2000 см ^-1 не отмечено ярко выраженных полос поглощения. Сделано предположение, что именно в этой области частот можно регистрировать изменения внутриклеточной организации, в частности состояния воды, по изменению спектральных характеристик. Для нативных клеток отмечено смещение основания полос поглощения спектров по шкале "пропускания".

Физический смысл явления можно понять при рассмотрении уравнения для глубины проникновения светового потока в образец

d = λ₁ / 2π (sin²θ - n₂₁ ²) ^1/2, (5.1)

где λ₁ = λ/n₁ - длина волны в оптически плотной среде;

θ - угол падения света;

n₂₁ = n₂ / n₁ - относительный показатель преломления;

n₁ - показатель преломления измерительного элемента;

n₂ - показатель преломления измеряемого слоя клеток.

Известно, что глубина проникновения луча в клетку прямо пропорциональна оптической плотности, регистрируемой в опыте. Все параметры, входящие в выражение (5.1), на определенной длине волны заданы и фиксированы, кроме одного - n₂. Следовательно, смещение основания полос поглощения спектров галофилов может происходить только за счет изменения показателя преломления клеток или их измеряемых слоев. Установлено, что увеличение интенсивности полос должно быть следствием увеличения d и возможно при увеличении n и наоборот.

Увеличение показателя преломления клеток возможно при уменьшении количества компонентов клеток с малыми показателями преломления или при замене (или преобразовании этих компонентов) на компоненты с более высоким показателем преломления. Самым маленьким показателем преломления из компонентов клетки обладает вода (n=1,3). Учитывая большую подвижность воды (проникновение в клетку, выход из нее, переход в различные состояния, например связанная вода) и то, что вода составляет наибольшую часть содержимого клетки, есть все основания предположить, что наблюдаемый эффект смещения основания полос поглощения спектров в определенные периоды жизни клетки вызван изменением водного баланса в микроорганизмах.

Таким образом, методом НПВО можно фиксировать (регистрировать) изменения водного баланса в клетках и в различных их слоях.