Типовые примеры выделения и очистки ферментных препаратов

Современное производство ферментных препаратов представляет собой многостадийный процесс, число стадий в котором достигает 15-17-ти. Рассмотрим в качестве примеров последовательность отдельных технологических операций, осуществляемых при выделении и очистке ферментных препаратов.

6.1. Получение a-амилазы из культуральной жидкости. 1. На первой стадии осуществляют отделение биомассы продуцента, пигментов, балластных белков. Для этого в культуральную жидкость, имеющую рН раствора около 6,0 и охлажденную до 15°С, добавляют на 1м 65л 2М раствора хлорида кальция. Образующийся в результате взаимодействия с присутствующими в культуральной жидкости фосфат-анионами фосфат кальция сорбирует на себе пигменты и белки и выпадает вместе с ними в осадок. Избыток ионов кальция способствует коагуляции биомассы. Далее полученный осадок отфильтровывают.

2. На второй стадии осуществляют отделение α -амилазы. Для этого в фильтрат, охлажденный до температуры 5°С, добавляют ацетон в соотношении 1:1. При этом осаждаются амилаза и часть (5-8%) протеазы. Сахара, соли, и другие низкомолекулярные продукты остаются в растворе. Полученный осадок отфильтровывают.

3. На третьей стадии проводят очистку от остаточных балластных примесей. Для этого осадок, полученный на предыдущей стадии, растворяют в воде, нерастворившуюся часть отделяют сепарацией, а к раствору добавляют смесь солей хлорида кальция и гидрофосфата аммония. Образующийся после этого осадок вновь отфильтровывают.

4. Данная стадия представляет собой дополнительную очистку от балластных белков. Ее осуществляют путем дробного добавления ацетона к раствору, полученному на предыдущей стадии, до соотношения 1:0,3. Вновь выпавший осадок направляют на фильтрацию.

5. На этой стадии осуществляют очистку от остатков протеазы путем повторного прибавления ацетона к водному раствору фермента с предыдущей технологической операциии в соотношении 1:1. Выпавший осадок отфильтровывают и направляют на стадию обесцвечивания.

6. Данную операцию проводят при растворении осадка, полученного на предыдущей стадии, в 0,02 М растворе ацетата кальция с последующим добавлением 5% активированного угля. После 24 часовой выдержки при небольшом перемешивании уголь отделяют сепарацией, а раствор фермента направляют на кристаллизацию.

7. Для этого исходный раствор охлаждают и дробно прибавляют ацетон до прекращения помутнения раствора. Выпавший осадок отделяют на центрифуге и высушивают.

В результате проведения всех технологических операций получают готовый ферментный препарат с выходом порядка 50%.

6.2. Получение нейтральной и щелочной протеаз. Технология процесса включает в себя следующие основные стадии:

1. Как и в предыдущем случае первоначально отделяют биомассу микро­организма - продуцента, пигменты и балластные белки в результате добавления хлорида кальция к раствору культуральной жидкости.

2. На данной стадии осуществляют концентрирование и обессоливание нативного раствора с помощью ультрафильтрации. Процесс проводят при температуре 12°С и значении рН раствора, близкого к 7,0. В результате ультрафильтрации нативный раствор концентрируется в 20 раз.

3. Стадия хроматографической очистки от пигментов на сорбенте ДЭАЭ - целлюлозе. Протеазы при этом не сорбируются.

4. Стадия дополнительной хроматографической очистки на сорбенте карбоксиметилцеллюлозе с последующим элюированием через него раствора хлорида натрия.

5. Заключительная стадия - кристаллизация. Ее проводят из водно-ацетонового раствора. Выпавшие кристаллы направляют на сушку.

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ