Выделение белков из биологического материала

Хотя около двух десятков белков удалось синтезировать, синтезы эти очень сложны, трудоемки, длительны и дороги. Поэтому единственно реальным методом получения белков служит их выделение их из природных источников. Познание строения белка – одна из актуальных проблем современности. На ее решении сосредоточены совместные усилия специалистов различных наук: биологии, физики, химии и математики.

Установить строение природного белка очень трудно вследствие сложности структуры, высокой молекулярной массы и чувствительности белковой молекулы к внешним воздействиям, приводящей к необратимым изменениям его строения. Это ограничивает выбор средств исследования строения белка. Весьма ответственной операцией является очистка белка с целью удаления воды и примесей минеральных солей.

Впервые белок (клейковина) был выделен Я. Беккари из пшеничной муки в 1728 году. Эту дату принято считать годом зарождения химии белка.

Аминокислотный состав белка устанавливают методом его гидролиза кислотами, щелочами или ферментами. Широко применяется кислотный гидролиз (80%-ная серная или 20%-ная соляная кислота), протекающий наиболее полно.

Для определения аминокислотного состава белка применяют различные физико-химические методы, например, распределительную и ионообменную хроматографию.

Выделение белков из какого-либо биологического материала (семян, листьев, плодов и т.д.) заключается в экстрагировании их тем или иным растворителем после измельчения этого материала. В качестве растворителей применяются вода, солевые растворы, водно-спиртовые растворы, слабые кислоты и щелочи. Полученный раствор белка затем обрабатывается тем или иным способом – нагревается, насыщается солями и диализируется, насыщается спиртом или ацетоном, нейтрализуется. При этом из раствора выделяется соответствующая фракция белков, которая отделяется и высушивается, причем последняя операция обычно осуществляется путем проведения препарата белка через спирт все возрастающих концентраций.

С помощью этих методов получено и исследовано огромное количество белков растительного и животного происхождения. Однако за последние годы стало очевидно, что применявшиеся ранее методы выделения белков весьма несовершенны. Установлено, что эти методы в большинстве случаев приводят к большей или меньшей денатурации белков. Вместе с тем было показано, что белки, считавшиеся ранее индивидуальными, однородными, в действительности представляют собой смеси или комплексы, состоящие из нескольких белков, различающихся по своим физическим, химическим и биологическим свойствам.

Эти результаты были получены благодаря новым принципам и методам выделения и исследования однородности белков, разработанным на различных белках животного происхождения, в первую очередь, на белках плазмы крови.

Какие же условия выделения обеспечивают получение неденатурированных препаратов белка?

1. Поддержание возможно более низкой температуры на всех этапах получения препарата белка. Установлено, что наилучшей является температура, близкая к температуре замерзания растворителя, применяемого для экстрагирования белков.

2. Поддержание рН на соответствующем уровне, близком к нейтральной реакции или же к изоэлектрической точке данного белка.

Таким образом, применение кислот и щелочей для экстрагирования белков недопустимо. Органические растворители – спирт и ацетон, применяемые для осаждения и сушки белков, могут вызвать их глубокую денатурацию, сопровождающуюся потерей растворимости и свойственной им ферментативной активности. Это можно наблюдать при осаждении какого-либо из растительных водорастворимых белков при помощи спирта или ацетона – белок становится совершенно нерастворимым в воде и теряет многие из свойственных ему ферментативных функций.

Однако осаждение белков органическими растворителями не вызывает денатурации при условии, если эта операция проводится при низких температурах (-3 или -5 ◦С).