Особливості ага М13 як вектора

1) здатність включати дуже великі вставки, оскільки впаковування не залежить від геному;

2) Рекомбінантні ДНК перетворюються в фагових частках у велику кількість копій 1-ланцюгових молекул;

3) Кожен з двох ланцюгів вбудованого фрагменту включ. в різні рекомбінантні клони.

Такий вектор використовується в основному для секвенування за методом Седжера.

31. Гібридні вектори.

Космиды – один из типов гибридных векторов, которые реплицируются, используя плазмидный тип репликации, и обладают способностью упаковываться in vitro в оболочки частиц фага λ. Типичная космида обладает способностью к репликации, содержит уникальные эндонуклеазные сайты и селективные маркеры, принадлежащие плазмидной ДНК, которая объединена с сегментом ДНК фага λ, содержащим соединенные липкие концы (соs -сайт). Космиды конструируют с помощью методов, применяемых при работе с

рекомбинантными ДНК. При расщеплении конкатемерной ДНК фага λ с помощью соответствующих эндонуклеаз образуются соs -сегменты, которые могут быть включены в стандартный плазмидный вектор. Для того чтобы могло произойти соединение по соs -сайту, достаточно фрагмента ДНК фага λ длиной всего лишь 250 п.н., включающего последовательности, необходимые для связывания терминазы и последующего раз- резания. Важной чертой большинства космидных векторов для клонирования является их способность включать вставки ДНК размером до 45 т.п.н.

Если кольцевую космидную ДНК разрезать по какому-то уникальному сайту, смешать с фрагментами ДНК, содержащими соответствующие липкие концы, и провести отжиг, то образуются длинные конкатемеры. При смешивании этих конкатемеров с белками, осуществляющими упаковку ДНК фага λ, они разрезаются по соs -сайтам и ДНК упаковывается обычным путем. Этот процесс позволяет отобрать вставки большой протяженности, поскольку для того, чтобы ДНК могла упаковаться в головки фага λ, расстояние между соs -сайтами должно составлять от 38 до 52 т.п.н. Как и в случае с λ-векторами, смесь конкатемеров является сложной и часто содержит векторные фрагменты без всяких вставок или со множеством повторяющихся вставок. Космиды по существу являются плазмидными векторами, ≪присвоившими≫ соs -сайт фага λ для осуществления эффективной упаковки in vitro.

Истинными гибридами между плазмидой и фагом являются фазмиды – линейные дуплексные молекулы ДНК, концы которых представляют собой сегменты ДНК фага λ, содержащие все гены, необходимые для литической инфекции, а средняя часть – линеаризованную плазмиду. Функции репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах

полностью сохранены. Обычно вектор содержит несколько тандемных повторов плазмидного сегмента, обеспечивающих необходимую для успешной упаковки ДНК протяженность генома. Один или несколько повторов в процессе конструирования рекомбинантных молекул заменяются вставкой (рис. 5.21). Подобно рекомбинантам фага λ и космид, фазмидные ДНК упаковываются in vitro перед инфекцией. Попадая в клетку Е. coli, фазмида реплицируется как фаговая ДНК, в результате чего на газоне чувствительных бактерий образуются бляшки. Однако если вектор содержит ген, кодирующий репрессор фага λ, то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг. Кроме того, если ген репрессора кодирует мутантный белок cI, инактивирующийся при повышенной температуре (температурочувствительный репрессор), то фазмида реплицируется, как плазмида при низкой температуре и как фаг – при повышении температуры на несколько градусов. Такая маневренность может оказаться весьма полезной.

32. Вектори на основі фага М 13.

Первым событием при репликации фага М13 вклетках Е. coli является превращение одноцепочечной ДНК в двухцепочечную кольцевую форму, т.е. синтез цепи, комплементарной инфицирующей цепи ДНК. Двухцепочечная ДНК детерминирует синтез примерно 300 своих копий, использующихся затем в качестве матриц при образовании одноцепочечных фаговых ДНК, упаковывающихся в фаговые частицы. Параллельно транскрибируются и транслируются фаговые гены, а на внутренней мембране клетки концентрируется основной капсидный белок. Зрелые одноцепочечные молекулы фаговой ДНК проходят через мембрану, захватывая при этом капсидный белок, в результате чего образуется большое количество зрелых фаговых частиц. Хотя инфицированные клетки не погибают, их рост замедляется, и на бактериальном газоне образуются мутные бляшки. Двухцепочечную репликативную форму ДНК можно легко выделить из инфицированных клеток, с тем чтобы использовать ее затем в качестве вектора, а одноцепочечная ДНК содержится в большом количестве в фаговых частицах в культуральной среде. Каждая клетка в каждом поколении высвобождает несколько сотен фаговых частиц. Одноцепочечные рекомбинантные молекулы являются особенно удобным объектом при изучении нуклеотидных последовательностей.

Векторы, сконструированные на основе фага М13

Как и в случае фага λ, путем различных модификаций генома фага М13 дикого типа были сконструированы разные удобные векторы. Для получения рекомбинантов использовались двухцепочечные репликативные формы, о которых говорилось выше. Одноцепочечные молекулы ДНК не применяют в качестве векторов, поскольку обычно их нельзя разрезать с помощью эндонуклеаз рестрикции типа II. Большая часть генома, состоящего примерно из 6400 нуклеотидных остатков, содержит гены, кодирующие белки оболочки, а также белки, участвующие в репликации и сборке. Область начала репликации состоит примерно из 150 нуклеотидов, находящихся внутри некодирующего сегмента длиной 507 нуклеотидов. В это сегмент может быть помещена вставка без нарушения способности М13 к репликации.

Типичный вектор. Вектор, представленный на рис. 5.17, сконструирован на основе ДНК фага М13. Для того чтобы было удобно проводить отбор рекомбинантов, фаговый геном дикого типа модифицировали, встроив в некодирующую область длиной 507 п.н. часть lаc-оперона Е. coli, включающую оператор, промотор и 5'-кодирующую область β-галактозидазного гена. В эту короткую область в свою очередь был встроен сегмент из 42 п.н., который содержал несколько сайтов узнавания для уникальных рестриктирующих эндонуклеаз. Каждый из этих сайтов можно было использовать для включения фрагментов ДНК с соответствующими липкими концами. Такой сегмент получил название полилинкера. Его введение не нарушает ни кодирующую рамку, ни активность N-концевой части β-галактозидазы. В отсутствие вставки в полилинкере векторный геном детерминирует синтез N-концевой части β-галактозидазы, которая вместе с С-концевой частью β-галактозидазы, продуцируемой специальными штаммами E.coli, образует активную β-галактозидазу. Бляшки, образуемые самим вектором при выращивании на агаре, содержащем Xgal, окрашиваются в голубой цвет. Однако после внедрения вставки в любой из рестрикционных сайтов полилинкера синтез N-концевой части β-галактозидазы нарушается и образуются бесцветные бляшки. Таким образом, среди большого числа бляшек, образуемых вектором без вставки, легко обнаружить бляшки, содержащие рекомбинантный вирус. Были получены производные фага М13, содержащие другие сайты для рестриктирующих эндонуклеаз и позволяющие использовать другие приемы для отбора рекомбинантов. В некоторых случаях отбор основывался на резистентности к антибиотикам, в других использовались гены, способные удовлетворять потребности соответствующих хозяев в определенных питательных веществах.

Одноцепочечные рекомбинантные ДНК. Системы, в которых в качестве вектора используется фаг М13, имеют несколько ценных свойств, характерных также для систем с плазмидными векторами (например, сохранение жизнеспособности клеток) и систем, где вектором служит фаг λ (рекомбинантные ДНК содержатся внутри фаговых частиц). Однако они обладают и некоторыми уникальными особенностями, например:

1. способность включать очень большие вставки, поскольку процесс упаковки ДНК не зависит от размера фагового генома.

2. способность двухцепочечных рекомбинантных ДНК превращаться во множество одноцепочечных молекул ДНК в фаговых частицах. Эта система позволяет включать каждую из цепей ДНК встроенного фрагмента в разные рекомбинантные клоны. Векторные молекулы фага М13, точно так же как плазмидные и λ-векторы, включают вставки в любой из двух возможных ориентации. Таким образом, клонирование любой вставки всегда дает начало двум разным видам фага, каждый из которых содержит одну из цепей вставки. Это свойство очень удобно для проведения детального анализа нуклеотидных последовательностей и для синтеза специфических радиоактивно меченных ДНК-зондов.

33. Вектори для еукаріотичних клітин.

Делятся на:

- векторы на основе дрожжей (плазмидные векторы, векторы ARS, мини-хормосомные векторы)

- на основе вируса SV-40 (трансдуцирующие SV-40-векторы, SV-40-плазмидные векторы, пассивные трансформирующие векторы)

- на основе вируса папилломы рогатого скота

В отличие от вируса SV40 папилломавирус крупного рогатого скота (BPV) реплицируется в виде стабильной плазмиды в клетках грызунов и многих клетках быка. Вирионы при этом не образуются, поскольку экспрессия капсидного белка, насколько это известно, происходит только в терминально дифференцированных эпидермальных клетках. Инфицированные клетки не погибают, и геном BPV передается дочерним клеткам. Такие геномы трансформируют клетки, вызывая в них генетические изменения, в частности превращая нормальные клетки в раковые.

- на основе ретровирусов

Репликация одноцепочечного РНК-генома ретровирусов включает следующие стадии: образование двухцепочечной ДНК, являющейся копией РНК, с помощью обратной транскриптазы; встраивание вирусной ДНК в геном хозяина; транскрипцию встроенной ДНК с образованием мРНК и дочерних вирусных геномов; синтез вирусных структурных

белков и обратной транскриптазы; сборку новыхвирусных частиц и высвобождение их из клетки. Необходимым условием продуктивности жизненного цикла ретровируса является наличие в его геноме определенных нуклеотидных последовательностей, способных функционировать только в цис- положении.

- плазмида рТі-А

Замкнутые кольцевые двухцепочечные плазмиды pTi имеют размер от 150 до 250 т.п.н. и содержат разнообразные уникальные гены. Бактерии A. tumefaciens попадают в пораженные ткани растений, а затем плазмиды проникают в растительные клетки и рекомбинируют с клеточной ДНК. В растительном геноме имеется несколько специфических сайтов интеграции. Трансформированные клетки образуют опухоли, получившие название корончатых галлов

34. Вектори на основі дріжджів.

Плазмидные векторы. Некоторые штаммы S. Cerevisiae содержат кольцевую двухцепочечную плазмиду длиной 6318 п.н. Эта так называемая 2 мкм-плазмидная ДНК содержит область ori репликации ДНК, другую цис-действующую область (REP3) и два гена (REP1 и REP2), которые вместе обеспечивают стабильное сохранение большого числа копий плазмиды – около 50 на дрожжевую клетку. Примерно 50% 2 мкм-плазмидной ДНК необходимы для ее репликации и сохранения в клетках, остальные 50% несущественны. 2 мкм-ДНК не содержит маркерных генов, которые позволяли бы отбирать дрожжевые клетки, несущие плазмиду. Поэтому ни сама плазмида, ни ее существенная часть не могут служить удобными векторами для дрожжевых клеток. Однако существенная часть 2 мкм-плазмиды была использована для конструирования челночного вектора путем объединения ее с плазмидой pBR322, которая содержала дрожжевой ген (HIS3), кодирующий один из ферментов биосинтеза гистидина. Используя такой вектор в сочетании с дрожжевым штаммом his3– в качестве хозяина, можно проводить отбор клеток, растущих в отсутствие гистидина. Оказалось, что дрожжевой ген HIS 3 функционален также в клетках Е. coli благодаря тому, что он содержит область,

гомологичную промотору Е. coli. Таким образом, дрожжевой ген HIS 3 может служить селективным маркером в бактериальных клетках, утративших аналогичный ген. Вектор содержит несколько уникальных рестриктазных сайтов, по которым можно встраивать определенные сегменты ДНК.

Векторы ARS. Дрожжевые векторы второго типа представляют собой кольцевую двухцепочечную ДНК, которая содержит область ori репликации дрожжевого генома. Обычно такие векторы являются челночными. При клонировании в pBR322 некоторых генов дрожжевой хромосомы (не HIS 3) образующиеся рекомбинантные молекулы могут реплицироваться автономно в клетках как E. coli, так и дрожжей. Среди генов, обеспечивающих способность к репликации, были TRP 1 и ARG 4, которые кодируют ферменты, необходимые для биосинтеза триптофана и аргинина соответственно. Оказалось, что область ori хромосомы расположена достаточно близко от каждого

из этих генов, чтобы включиться в клонируемые дрожжевые сегменты. Размер областей начала репликации ori не превышает 100 п.н. Такие области получили название автономно реплицирующихся последовательностей (или ARS). Все ARS- последовательности содержат одинаковый олигонуклеотид 5'-ATТТТАТAGТТТAT-3', необходимый для функционирования. Этот олигонуклеотид длиной 11 п.н. окружен другими важными в функциональном отношении последователностями, но они варьируют от одного ARS- элемента к другому. Любая кольцевая двухцепочечная ДНК, которая содержит ARS -последовательность, может служить дрожжевым вектором и использоваться для непосредственного клонирования в дрожжевых клетках. Такие

молекулы способны стабильно существовать в клетках S. cerevisiae до тех пор, пока они являются единственным носителем какого-то необходимого гена (например, гена TRP 1 в клетках t r p 1–, выращиваемых в отсутствие триптофана), однако при снятии селективного давления они быстро утрачиваются.

Мини-хромосомные векторы. Дрожжевые векторы третьего типа ведут себя аналогично функциональной хромосоме, хотя и имеют меньшие размеры. Такие мини-хромосомные векторы реплицируются только один раз в каждом поколении клеток, и две образующиеся копии сегрегируют, как истинные хромосомы, распределяясь по дочерним клеткам во время мейоза и митоза. Необходимыми элементами функциональной мини-хромосомы являются три небольших сегмента хромосомной ДНК дрожжей. Один из них, ARS, содержит область ori репликации ДНК, второй создает усло-

вия для отбора. Третий сегмент, CEN, регулирует число копий внутри клеток и отвечает за способность к сегрегации в течение многих поколений. Сегменты ДНК, которые придают мини-хромосоме такое замечательное свойство,– это центромеры, и происходят они из центромерных областей дрожжевых хромосом (отсюда обозначение CEN). Их размеры не должны превышать 500 п.н.

35. Вектори на основі віруса SV 40.

Вирус и его геном. SV40 – это сферический вирус; его геном представлен одной замкнутой кольцевой двухцепочечной ДНК (рис. 5.34). Вирусная частица содержит три структурных кодируемых вирусом белка. VP1 – главный белок вириона, он является

основной составной частью капсида; VP2 и VP3 представлены в меньших количествах. ДНК в вирусной частице находится в форме хроматина и связана с четырьмя гистонами. Расшифрована нуклеотидная последовательность всего генома SV40, состоящая из 5243 п.н., и установлены участки, кодирующие пять вирусных белков: малый Т-антиген, большой Т-антиген, VP1, VP2 и VP3. Вирион SV40, проникнув в клетку, направляется

к ядру. Здесь происходит его ≪раздевание≫, а затем в строгой временной последовательности– экспрессия генов. Новые вирусные частицы появляются примерно через 30 ч после инфицирования монослоя клеток почки обезьяны, а через 4 сут все клетки разрушаются. Первыми транскрибируются гены двух ранних белков, малого и большого Т-антигенов, в направлении против движения часовой стрелки. Сайт полиаденилирования находится на карте вблизи нуклеотида 2550. Ни малый, ни большой Т-антигены не входят в состав зрелых вирусных частиц, однако большой Т-антиген играет

важную роль в репликации вирусной ДНК, начинающейся вскоре после образования ранних белков. Репликация начинается в точке ori, идет в обоих направлениях и заканчивается в месте встречи репликативных вилок. Затем происходит сшивание дочерних двухцепочечных молекул ДНК с образованием замкнутых кольцевых структур. В каждой инфицированной клетке образуется более 105 копий вирусного генома. Вскоре после инициации репликации ДНК замедляется синтез ранних белков и активизируется транскрипция ≪поздних≫ генов, которая начинается вблизи ori и протекает в направлении движения часовой стрелки, в результате чего синтезируются поздние белки VP1, VP2 и VP3. Накопление дочерних молекул ДНК и вирионных белков завершается сборкой новых вирусных частиц, их высвобождением и гибелью клетки.

Различают три типа векторов,сконструированных на основе вируса SV40. Каждый

из них имеет свои преимущества и недостатки при использовании в различных экспериментальных системах. Во-первых, это трансдуцирующие SV40-векторы, реплицирующиеся в соответствующих клетках-хозяевах (клетки почек обезьяны) и упаковывающиеся в вирионы. Они аналогичны специализированным трансдуцирующим фагам и векторам, сконструированным на основе фага λ. Во-вторых, это SV40-векторы, способные реплицироваться, но не упаковываться. Они называются плазмидными SV40-векторами. И наконец, существуют пассивные трансформирующие векторы, которые не способны ни реплицироваться, ни упаковываться. Они представляют собой молекулы, в которые включены небольшие сегменты генома SV40, способствующие экспрессии генов.

Трансдуцирующие SV40-векторы. Чтобы SV40-вектор мог упаковываться с образованием вирусных частиц, необходимо выполнение трех важных требований. Во-первых, вектор должен содержать сегмент размером 300 п.н., включающий точку ori. Это необходимо для обеспечения синтеза вирусной ДНК и регуляторных последовательностей, отвечающих за синтез мРНК. Во-вторых, суммарная длина рекомбинантной ДНК не должна превышать

5300 п.н. и быть меньше 3900 п.н., т.е. вектор должен иметь определенный размер, необходимый для упаковки ДНК в вирусные частицы. В-третьих, должны быть в наличии белки большой Т-антиген, VP1, VP2 и VP3, хотя их кодирование самим рекомбинантным геномом необязательно. К интактному геному SV40 уже практически невозможно добавить какой-то фрагмент ДНК, чтобы не было нарушено условие, при котором может происходить его упаковка. Поэтому общая стратегия состоит в делетировании кодирующей области вектора, замещении ее нужным фрагментом ДНК и обеспечении синтеза продукта утраченного гена с помощью аналогичного гена, входящего в состав

генома либо вируса-помощника, либо хозяина (т.е. возмещении гена в транс -положении). Например, вирус-помощник дикого типа способен синтезировать белки Т или VP1, VP2 и VP3 в количестве, достаточном для удовлетворения как собственных нужд, так и нужд рекомбинантного вируса.

SV40-плазмидные векторы. SV40-векторы второго типа способны реплицироваться в клетках обезьян, но не могут упаковываться с образованием вирусных частиц. Для них существенно сохранение как области ori репликации, так и гена большого Т-антигена, в то время как гены белков VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. С другой стороны, синтез большого Т-антигена может обеспечиваться и клетками COS. Плазмидные SV40-векторы могут быть челночными и существовать в клетках Е. coli и животных, поскольку никаких ограничений на их размер, необходимый для упаковки, не налагается. Рекомбинантные молекулы получают в клетках Е. coli, а затем трансфицируют ими клетки обезьяны. Такие клетки могут использоваться для изучения временной экспрессии генов, встроенных в векторные молекулы. Поскольку при репликации вектора образуется большое число копий, доза любого гена, содержащегося в векторе, увеличивается, что облегчает изучение соответствующих генных продуктов. сохранение как области ori репликации, так и гена большого Т-антигена, в то время как гены белков VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. С другой стороны, синтез большого Т-антигена может обеспечиваться и клетками COS. Плазмидные SV40-векторы могут быть челночными и существовать в клетках Е. coli и животных, поскольку никаких ограничений на их размер, необходимый для упаковки, не налагается. Рекомбинантные молекулы получают в клетках Е. coli, а затем трансфицируют ими клетки обезьяны. Такие клетки могут использоваться для изучения временной экспрессии генов, встроенных в векторные молекулы. Поскольку при репликации вектора образуется большое число копий, доза любого гена, содержащегося в векторе, увеличивается, что облегчает изучение соответствующих генных продуктов. Однако плазмидные векторы оказываются нестабильными в большинстве клеток животных и не могут сохраняться в них бесконечно долго.

Пассивные трансформирующие векторы. Векторы третьего типа не способны к самостоятельной репликации. Они лишь доставляют в клетку клонированные сегменты ДНК, которые затем внедряются в клеточную ДНК. Образующиеся стабильно трансформированные клетки реплицируют приобретенную ДНК как часть своего собственного, генома. Обычно такие векторы напоминают челночные, поскольку сначала для клонирования и выделения рекомбинантных ДНК используют клетки Е. coli, а затем трансфицируют этой ДНК различные клетки млекопитающих.

36. Вектори, що використовуються в генетичній інженерії рослин.