Виды генетической рекомбинации у бактерий

Заключительным этапом при любой форме обмена генетическим материалом является рекомбина­ция между привнесенной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. Если переносится одна нить ДНК, то она вначале достраивается комплементарной ей нитью; рекомбинируют между собой только двуните-вые ДНК. Различают общую рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию и рекомбинацию, контролируемую транспонируемыми элементами. Общая рекомбинация происходит между гомологич­ными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация происходит за счет наличия специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК. Ее примером является специфическая рекомбинация между умерен­ным фагом X и хромосомой E.coli. Как в бактериальной хромосоме, так и в ДНК фага X имеются специфические участки (attB и attP соответственно), между которыми и происходит сайт-специфиче­ская рекомбинация. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном гесА.

Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, тоже являются сайт-специфически­ми, но специфичность этих сайтов связана с особыми нуклеотидными последовательностями, и эта форма рекомбинации не зависит от гесА-гена.

Главным генетическим детерминантом всех путей рекомбинации является ген гесА. Его поврежде­ние полностью исключает возможность образования рекомбинантов. Основной путь гесА-рекомбинации осуществляется с участием продуктов генов гесВ и гесС (они кодируют синтез эндонуклеазы V). В случае мутации по гесВ и гесС выход рекомбинантов составляет около 20% от гес+. Однако эти мутации могут быть исправлены путем механизмов супрессии в двух генах: sbcA- и sbcB». Супрес­сии sbcA~ открывают дополнительный путь рекомбинации через ген гесЕ (его продукт — экзонуклеа-за VIII). Супрессии sbcB~ реализуют рекомбинации через ген recF (структурный ген экзонуклеазы I). Таким образом, генетический контроль рекомбинаций носит сложный характер.

Изучение его механизма — одна из центральных задач молекулярной генетики. Особый интерес представляет изучение механизма гомологической рекомбинации. Это определяется перспективами развития молекулярной медицины. Одной из важнейших стратегических задач, поставленных перед программой «Геном человека», является обнаружение изменений первичной структуры ДНК, которые приводят к нарушению функции генов и, как следствие этого, к развитию наследственных заболева­ний человека. Идеальным методом лечения их является генотерапия, основанная на замене повреж­денного («больного») гена здоровым в месте его локализации на хромосоме. Такая замена может быть осуществлена только с помощью гомологической рекомбинации, механизмы которой у бактерий и эукариот, очевидно, во многом сходны. У бактерий выявлены два способа такой рекомбинации, осуществляемых двумя типами рекомбиназ: АТФ-зависимым белком RecA и АТФ-независимой ренату-разой. Соответственно, и у эукариот обнаружены АТФ-зависимые и АТФ-независимые ДНК-трансфе-разы, среди которых найдены белки, функционально сходные с RecA-белком бактерий.

Решающая роль в гомологической рекомбинации у бактерии, как указано выше, принадлежит гену гесА. Его продукт — белок RecA с м.м. 38 кД — обладает рядом уникальных функций: 1)он прочно связывается с одиночными нитями ДНК; 2)способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; 3)он одновременно может присоединяться и к двойной спирали ДНК, и к одиночной нити и удерживать их вместе; 4)он обладает свойством ДНК-зависимой АТФ-азы. Бл_агодаря этому свойству

обеспечивается серия конформационных превращений, которые обусловливают превращение трехните-вого комплекса с неспаренными основаниями в трехнитевый комплекс со спаренными основаниями. С помощью этой реакции происходит прямое комплементарное взаимодействие между одиночной нитью ДНК и двойной спиралью — главное событие в процессе рекомбинации. Энергия гидролиза АТФ RecA-белком используется последним для продвижения одиночной нити вдоль двойной спирали ДНК с целью нахождения того ее участка, который имеет гомологичную последовательность нуклеотидов, необходимую для замыкания водородных связей, т. е. для спаривания.

Для объяснения механизма гомологической рекомбинации предложены разные модели. В соответ­ствии с наиболее популярной моделью, рекомбинация инициируется с помощью однонитевого разры­ва в одной из двух гомологичных молекул ДНК, вызываемого эндонуклеазой, которая кодируется генами гесВ и гесС. Образующийся при этом конец (3'- или 5'-конец) однонитевой ДНК (онДНК) атакует двойную спираль другой молекулы ДНК, отыскивая в ней гомологичный участок, и образует временную трехнитевую структуру (рис. 48.1). В результате спаривания атакующей молекулы онДНК с комплементарной нитью другой молекулы ДНК происходит выталкивание ее освобождающейся нити (рис. 48.2), которая в свою очередь спаривается с комплементарной нитью другой молекулы ДНК. Во время этих событий часто наблюдается удаление некоторого количества нуклеотидов, репара­ция образующейся бреши и лигирование ДНК, но в конечном счете образуется (рис. 48.3) предсказан­ная Р. Холидеем полухиазма [от греч. chiasmos — расположение в виде греческой буквы X (хи)]. На рис. 48.3 парными стрелками указаны места «разрешения» полухиазмы. Разрешение в одном варианте (полые стрелки) приведет к обмену фрагментами онДНК между спаривающимися молекулами ДНК, в другом (черные стрелки) — к полному кроссинговеру на уровне двунитевых ДНК.

В случае обмена с перекрещиванием нитей обе гомологичные спирали ДНК после начального этапа спаривания удерживаются вместе благодаря перекрестному обмену нитями из имеющихся четырех — по одной нити от каждой спирали. Структура, образующаяся при этом, обладает двумя важными свойствами:

Точка обмена между двумя гомологичными спиралями, т. е. место, где скрещиваются две их нити, может быстро мигрировать по спирали. Этот процесс получил название миграции ветвей. Миграция может значительно увеличивать области спаривания между двумя взаимодействующими нитями, изначально принадлежавшими разным молекулам ДНК.

Эта структура, благодаря вращению составляющих ее элементов относительно друг друга, может находиться в различных изомерных формах. Изомеризация изменяет положение двух пар нитей: две ранее перекрещивающиеся нити становятся неперекрещивающимися, и наоборот. Для прекращения процесса спаривания в каждой из двух нитей должен произойти разрыв. Если он произойдет до изомеризации, у каждой спирали будет заменена только одна из нитей и только на коротком отрезке. Если же разрыв произойдет после изомеризации, наступит полный кроссинговер.

Фермент ренатураза (33 кД) кодируется у E.coli геном гесЕ. Он относится к классу «гомологических ДНК-синаптаз», которые, в отличие от RecA-белка, не обладают ДНК-трансферазной активностью и не зависят от АТФ. Эти белки участвуют в реакциях гомологической рекомбинации, индуцированных двунитевыми разрывами ДНК.

Ген гесА участвует не только в процессе рекомбинации, его продукт необходим для постреплика-тивной репарации, индукции профага, клеточного деления и ряда других жизненно важных для бактерий функций. Рецессивные мутации в этом гене неизбежно отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность объединена в единую SOS-систему

(от англ. SOS — сигнал бедствия — save our souls — спасите наши души или save our ship — спасите наш корабль).

Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гесА-гена. SOS-система срабаты­вает после любых воздействий на ДНК агентами, которые повреждают ее структуру, или нарушают нормальный процесс ее репликации, или нарушают другие функции. Поэтому гесА-гену принадлежит ведущая роль в обеспечении самозащиты генетической системы бактериальной клетки.